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Biochimica

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

Published: February 07, 2022
doi:
10.3791/62765
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of California, San Diego

Summary

この原稿は、単粒子低温電子顕微鏡用の生物学的標本を手動で凍結するブロット・アンド・プランジ法の概要を説明している。

Abstract

単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)による高解像構造決定のための電子を用いた生物学的標本のイメージングには、目的の生体分子を含む亜粒子の薄層が必要です。近年、単粒子cryoEMを構造生物学の最前線に押し上げた多くの技術進歩にもかかわらず、高解像イメージングのために標本をガラス化する方法は、しばしばレート制限ステップのままです。新しいサンプルサポートや革新的なガラス化計器の開発など、標本ガラス化中に頻繁に遭遇するハードルを克服するための多くの最近の努力が提供されていますが、従来の手動操作プランジャーは、購入コストが低く、操作が容易であるため、cryoEMコミュニティの定番のままです。ここでは、単粒子クライオEMによる高解像度イメージングのための生物学的標本のガラス化のための標準のギロチンスタイルの手動操作ブロットとプランジデバイスを使用するための詳細な方法を提供します。また、標準的な準備が適切な標本を得られなかった場合に関する一般的な問題とトラブルシューティングの推奨事項も説明します。

Introduction

単粒子低温電子顕微鏡(クライオエム)は、動的生物学的標本の構造を原子に近い分解能1,2,3,4に解決するために使用できる強力な構造技術です。実際、最近の直接電子検出器技術の進歩 4,5,6,7,8,9,10, 電子源の改善 4,11,12,13,14,電磁気レンズ安定性15と相まってデータ取得の継続的な発展16,17および分析ソフトウェアパッケージ18,19は、研究者が3 Å解像度またはより良い3Åに行き届いた標本の構造を日常的に決定することを可能にしました4,11,11,13,14,20,21,22,23.これらの改善された画像およびデータ処理機能にもかかわらず、cryoEMグリッドの準備は、高解像構造の決定を成功させるための最大の障害であり、しばしばEMワークフロー24、25、26、27においてかなりのボトルネックとなる。

CryoEMは、天然の生化学的状態を維持する「ガラス状」氷(ガラス化と呼ばれるプロセス)の薄膜を形成するために凍結された水溶液中の生物学的サンプルのイメージングに依存しています。クライオEM用の生物学的サンプルのガラス化は40年以上前までさかのぼり、このプロセスのために開発された多くの技術や機器は、当初の詳細なブロットとプランジ法に依存しています31,32,33,34,35 これは、過剰な溶液がブロッティング紙とのグリッドの物理的相互作用を使用して除去される前に、少量のサンプル(例えば、1〜5 μL)が特殊なEMグリッドに適用される。このプロセスのタイミングは、通常、氷のサンプルの重要な成分が膜膜の厚さであるように各標本について経験的に決定されます – 氷が厚すぎると、薄すぎる氷がタンパク質の配向を制限したり、グリッド箔の中心から粒子を除外することができますが、電子ビームの散乱の増加によりイメージング品質が劇的に悪化します36.単粒子クライオEMのための完璧な氷の厚さにこの依存は、ロボティクス37,38、マイクロ流体42、超音波または噴霧装置27,39,40,41,42,43,44を含むサンプルを凍結できる幅広い技術と機器につながっています。.近年、最も人気のあるサンプル調製装置のいくつかは、ブロットとプランジ技術45を使用してサンプルの自動凍結のためのロボット工学の使用に依存しています。これらのデバイスは、イメージング用の適切な氷の厚さを再現的に作成するように設計されていますが、個々のラボが購入して動作するには高価すぎることが多く、一般的にcryoEM施設内で使用のために毎時の料金で見られます。近年、オリジナルのマニュアルブロットアンドプランジ技術は、使用数が増加し、3,47,48,49,50,51,52に戻ってきました。実際、手動で操作されたブロットとプランジデバイスは、ロボットの対応するコストのほんの一部で高品質のクライオEMグリッドを実現できます。さらに、手動ブロッティングは、研究者がブロッティングの種類(すなわち、グリッドのバックブロット、グリッドのフロントブロッティングなど)、および個々のサンプルと研究の質問に基づいてブロット時間を調整できるため、より多くのユーザーがブロッティングを制御することができます。

本稿では、従来の手動ブロットとプランジガラス化装置を使用して、カスタム設計のデュワープラットフォーム53と組み合わせて生物学的サンプルを効果的に凍結する方法について詳しく説明します。クライオゲンの準備、グリッド処理、サンプルアプリケーション、ブロッティングなどのベストプラクティス、これらのハードルを克服する方法に関する一般的な落とし穴と推奨事項が提供されています。グリッド調製の間の氷の厚さを向上させる方法と、生物学的標本の種類に基づいてサンプルブロッティングを変更する方法についてのアドバイスが議論されています。この原稿に記載されている手動プランジャーの購入と操作に関連する低コストを考えると、世界中のラボは、コスト効率が良く再現可能な方法でcryoEMの生物学的標本を調製することができます。

Protocol

1. 手動の突っ込み環境を準備する 注意:予想運転時間:5~30分 加湿器を同じ場所に設置できる4°Cの冷たい部屋で手動プランジャーを探して、相対湿度(RH)の100%近くを維持します(図1A)。注意:手動プランジャーと推奨操作の安全な場所については、施設の環境安全衛生ガイドラインに従ってください。 グリッドの準備の前に、冷たい部?…

Representative Results

ここで説明するブロット・アンド・プランジプロトコルの実行に成功すると、電子顕微鏡下で観察できる六角形の氷、汚染物質、および使用できない氷の大きな勾配のない薄く均一な層のビトレウス氷が生じる(図3)。ブロッティング紙とグリッド表面との接触が一貫していない、ブロッティング紙を早期に取り外す、またはグリッド接触中にブロッティング紙を動かす?…

Discussion

単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)によるイメージングのための生物学的標本のガラス化は、構造決定を成功させるための極めて重要なステップであり続ける。このプロトコルで説明されている手動のブロットとプランジ法は、クライオEMイメージング用の氷の薄膜中の生物学的サンプルを迅速に凍結するための費用対効果の高い、信頼性の高い、堅牢な方法を表します。原稿に記載されている方…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、この原稿とビデオコンテンツについて批判的に考え、フィードバックを提供してくれたHerzikラボのメンバーに感謝します。M.A.H.Jr.はNIH R35 GM138206およびサール学者によってサポートされています。H.P.M.Nは分子生物物理学トレーニンググラント(NIH T32 GM008326)によってサポートされています。また、スクリプス研究所のビル・アンダーソン、チャールズ・ボウマン、ガブリエル・ランダー博士に感謝し、ビデオに示されている手動プランジャーの設計、組み立て、テストを支援したいと思います。

Materials

4 slot grid storage box Ted Pella 160-40
14 gauge flat metal dispensing tip Amazon B07M7YWWLT
22×22 mm square glass coverslip Sigma C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids Fisher 08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper Fisher 08-747F
250 mL beaker Fisher 02-555-25B
Blue styrofoam dewar Spear Lab FD-500
Brass ethane vessel Lasco 17-4075
Clamping tweezers Ted Pella 38825
Delicate task wipes Fisher 06-666
Dual-stage regulator with control valve Airgas Y12N245D580-AG
Dewer grid base UCSD
Ethane platform UCSD
Ethane propane tank Praxair ET PR50ZU-G ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank Praxair UN1035 ethane (100%)
Flexible arm task light Amscope LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q325AR1.3
Humidifier Target 719438
Hygrometer ThermoPro B01H1R0K68
Lab coat UCSD
Liquid Nitrogen dewar Worthington LD4
Liquid Nitrogen gloves Fisher 19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal) UCSD
Mark 5 (plunging platform) UCSD
Nitrile gloves VWR 82026-424
P20 pipette Eppendorf 13-690-029
PCR tubes Eppendorf E0030124286
Pipette tips ibis scientific 63300005
Ring lamp Amazon B07HMR4H8G
Safety glasses UCSD
Scissors Amazon Fiskars 01-004761J
Screw driver Ironside 354711
Tape Fisher 15-901-10R
Tweezer to transfer grid box Amazon LTS-3
Tygon tubing Fisher 14-171-130
Whatman blotting paper Fisher 1001-090
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Riferimenti

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
  53. Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).

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Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, Jr., M. A. Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e62765, doi:10.3791/62765 (2022).
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