Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje
Summary
Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.
Abstract
Het in beeld brengen van biologische monsters met elektronen voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) vereist een dunne laag glasachtig ijs met de biomoleculen van belang. Ondanks tal van technologische ontwikkelingen in de afgelopen jaren die cryoEM met één deeltje naar de voorhoede van de structurele biologie hebben gedreven, blijven de methoden waarmee monsters worden verglaasd voor beeldvorming met hoge resolutie vaak de snelheidsbeperkende stap. Hoewel tal van recente inspanningen middelen hebben geboden om hindernissen te overwinnen die vaak worden ondervonden tijdens het verglaasen van monsters, waaronder de ontwikkeling van nieuwe monstersteunen en innovatieve vitrificatie-instrumenten, blijft de traditionele handmatig bediende plunjer een hoofdbestanddeel in de cryoEM-gemeenschap vanwege de lage aanschafkosten en het bedieningsgemak. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het gebruik van een standaard, guillotine-achtig handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat voor de vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming met hoge resolutie door cryoEM met één deeltje. Daarnaast worden ook veelvoorkomende problemen en aanbevelingen voor het oplossen van problemen beschreven voor wanneer een standaardpreparaat geen geschikt monster oplevert.
Introduction
Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is een krachtige structurele techniek die kan worden gebruikt om structuren van dynamische biologische monsters op te lossen tot een bijna atomaire resolutie1,2,3,4. Inderdaad, recente ontwikkelingen in directe elektronendetectortechnologieën4,5,6,7,8,9,10, verbeteringen in elektronenbronnen4,11,12,13,14 en elektromagnetische lensstabiliteit15, gekoppeld aan de voortdurende ontwikkeling van gegevensverzameling 16,17 en analysesoftwarepakketten18,19 hebben onderzoekers in staat gesteld om nu routinematig structuren van goed opgevoede monsters te bepalen tot een resolutie van 3 Å of beter4,11,13,14,20,21,22,23 . Ondanks deze verbeterde beeldvormings- en gegevensverwerkingsmogelijkheden blijft cryoEM-rastervoorbereiding de grootste belemmering voor succesvolle structuurbepaling met hoge resolutie en dient het vaak als een aanzienlijk knelpunt in de EM-workflow24,25,26,27.
CryoEM vertrouwt op de beeldvorming van biologische monsters in waterige oplossingen die worden ingevroren om een dunne film van “glasachtig” ijs te vormen – een proces dat bekend staat als vitrificatie – dat de inheemse biochemische toestand behoudt. Vitrificatie van biologische monsters voor cryoEM dateert van meer dan 40 jaar28,29,30 en veel technieken en apparatuur die voor dit proces zijn ontwikkeld, zijn gebaseerd op de oorspronkelijk gedetailleerde blot-and-plunge-methode31,32,33,34,35 , waarbij een klein volume monster (bijv. 1-5 μL) wordt aangebracht op een gespecialiseerd EM-raster voordat de overtollige oplossing wordt verwijderd met behulp van fysieke interactie van het raster met vloeipapier. De timing van dit proces wordt meestal empirisch bepaald voor elk monster, omdat een cruciaal onderdeel van vriesmonsters de dikte van de glasvochtijsfilm is – als het ijs te dik is, verslechtert de beeldkwaliteit dramatisch als gevolg van verhoogde verstrooiing van de elektronenbundel, terwijl ijs dat te dun is, eiwitoriëntaties kan beperken en / of deeltjes uit het midden van het rasterfoliegaten kan uitsluiten36 . Deze afhankelijkheid van de perfecte ijsdikte voor cryoEM met één deeltje heeft geleid tot een breed scala aan technieken en apparatuur die monsters kunnen bevriezen, waaronder robotica37,38, microfluïdica42 en ultrasone of spuitapparatuur27,39,40,41,42,43,44 . In de afgelopen jaren vertrouwen enkele van de meest populaire monstervoorbereidingsapparaten op het gebruik van robotica voor het automatisch invriezen van monsters met behulp van de blot-and-plunge-techniek45. Hoewel deze apparaten zijn ontworpen om reproduceerbaar de juiste ijsdikte te creëren voor beeldvorming, blijven ze vaak te duur voor individuele laboratoria om te kopen en te bedienen en worden ze over het algemeen gevonden in cryoEM-faciliteiten tegen uurtarieven voor gebruik. In de afgelopen jaren is de oorspronkelijke handmatige blot-and-plunge-techniek weer in gebruik gekomen3,47,48,49,50,51,52. Inderdaad, een handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat kan cryoEM-roosters van hoge kwaliteit bereiken tegen een fractie van de kosten van robotachtige tegenhangers. Bovendien biedt handmatige blotting ook meer controle over blotting, omdat onderzoekers het type blotting (d.w.z. back-blotting van het raster, front-blotting van het raster, enz.) en blottingtijd kunnen aanpassen op basis van elke individuele steekproef en onderzoeksvragen.
In dit artikel geven we details over hoe biologische monsters effectief kunnen worden ingevroren met behulp van een traditioneel handmatig vlek-en-dompel vitrificatie-apparaat in combinatie met een op maat ontworpen dewar-platform53. Best practices, waaronder de voorbereiding van het cryogene, rasterbehandeling, monstertoepassing en blotting, evenals veelvoorkomende valkuilen en aanbevelingen over hoe deze hindernissen kunnen worden overwonnen, worden verstrekt. Advies over het verhogen van de reproduceerbaarheid van de ijsdikte tussen rasterpreparaten en het wijzigen van monstervlekken op basis van het biologische specimentype worden besproken. Gezien de lage kosten die gepaard gaan met de aankoop en bediening van de handmatige plunjer die in dit manuscript wordt beschreven, kunnen laboratoria over de hele wereld biologische monsters op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier voorbereiden op cryoEM.
Protocol
Representative Results
Discussion
De vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) blijft een uiterst belangrijke stap voor succesvolle structuurbepaling. De handmatige blot-and-plunge-methode die in dit protocol wordt beschreven, vertegenwoordigt een kosteneffectieve, betrouwbare en robuuste methode voor het snel invriezen van biologische monsters in dunne films van glasachtig ijs voor cryoEM-beeldvorming. Met behulp van de methoden die in het manuscript worden beschreven, kunnen o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de Herzik-lableden voor het kritisch nadenken en het geven van feedback op dit manuscript en de video-inhoud. M.A.H.Jr. wordt ondersteund door NIH R35 GM138206 en als Searle Scholar. H.P.M.N wordt ondersteund door de Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). We willen ook Bill Anderson, Charles Bowman en Dr. Gabriel Lander van het Scripps Research Institute bedanken voor hun hulp bij het ontwerpen, assembleren en testen van de handmatige plunjer die in de video wordt getoond.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
Riferimenti
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
