מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להפנמת ATP בתיווך מקמפונוציטוזיס בתאי גידול אנושיים ועכברים קסנוגרפטים
Summary
פיתחנו שיטה הניתנת לשחזור כדי לדמיין את ההפנמה של אדנוסין טריפוספט פלואורסצנטי לא הידרוליזנטי (ATP), תחליף ATP, עם רזולוציה תאית גבוהה. אימתנו את השיטה שלנו באמצעות במבחנה עצמאית ובקווי תאי גידול אנושיים של vivo ועכברים חיסוניים קסנוגרפטים עם רקמת גידול אנושית.
Abstract
אדנוסין טריפוספט (ATP), כולל ATP חוץ תאי (eATP), הוכח לשחק תפקידים משמעותיים בהיבטים שונים של tumorigenesis, כגון עמידות לתרופות, מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT), גרורות. eATP תוך-טבעי הוא 103 עד10 פעמים גבוה יותר בריכוז מאשר ברקמות רגילות. בעוד eATP מתפקד כשליח כדי להפעיל איתות purinergic עבור אינדוקציה EMT, הוא גם מופנם על ידי תאים סרטניים באמצעות macropinocytosis upregulated, סוג מסוים של אנדוציטוזיס, כדי לבצע מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. פונקציות אלה כוללות מתן אנרגיה לתגובות ביוכימיות הדורשות ATP, תרומת קבוצות פוספט במהלך העברת אותות, והקלה או האצה של ביטוי גנים כקופקטור תמלול. ATP זמין, והמחקר שלו בסרטן ובתחומים אחרים ללא ספק יגדל. עם זאת, מחקר eATP נשאר בשלב מוקדם, ושאלות לא פתורות נשארות ללא מענה לפני שניתן יהיה לפענח לחלוטין את הפעילויות החשובות והרב-תכליתיות שמפעילים eATP ו-ATP תאי מופנמ.
תרומות המעבדות של מחברים אלה למחקרי eATP מוקדמים אלה כוללות הדמיה מיקרוסקופית של ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזנטי, יחד עם דקסטרנס פלואורסצנטי במשקל גבוה ונמוך, המשמשים כמעקבי מאקרופינוציטוזיס ואנדוציטוזיס, כמו גם מעכבי אנדוציטוזיס שונים, כדי לפקח ולאפיין את תהליך ההפנמה eATP. שיטת הדמיה זו הוחלה על קווי תאים של גידול ועל עכברים חיסוניים, קסנוגרפט עם גידולים סרטניים אנושיים, כדי לחקור הפנמה eATP במבחנה וב- vivo. מאמר זה מתאר את פרוטוקולי ההפנמה של הפריה ויוו, בדגש על שינוי ותנאי בדיקת מדוקפינוציטוזיס-/אנדוציטוזיס בתיווך eATP ניתן לבצע בהצלחה במערכות שונות.
Introduction
ספיגה אופורטוניסטית של חומרים מזינים חוץ תאיים תוך-סרטיים (כלומר) הוכרזה לאחרונה כסימן היכר מרכזי לחילוף החומרים של הסרטן1. אחד החומרים המזינים החשובים האלה הוא ATP, כמו הריכוז של ieATP הוא 103 ו10 4 פעמים גבוה יותר מזה שנמצא ברקמות רגילות, בטווח של כמה מאות מיקרומטרים עד mM נמוך2,3,4,5. כמולקולת אנרגיה ואיתות מרכזית, ATP ממלא תפקיד מרכזי בחילוף החומרים התאי בתאים סרטניים ובריאים6,7,8. ATP חוץ תאי מעורב לא רק צמיחת תאים סרטניים, אבל זה גם מקדם עמידות לתרופות9. בעבר פונקציות לא מזוהות של ATP, כגון פעילות הידרוטרופית, זוהו לאחרונה, ובכך לסבך מעורבות ATP במחלות כגוןאלצהיימר 10. ואכן, נראה שההבנה שלנו לגבי ATP ותפקודיו בתאים סרטניים, תאים בריאים ותאים חולים אחרים רחוקה מלהיות שלמה. עם זאת, בשל חוסר היציבות של ATP ושיעורי מחזור גבוהים בתאים, זה מאתגר מבחינה טכנית לפקח על התנועה של ATP על פני קרום התא לתוך התא.
כדי לטפל בבעיה זו ולמלא את הצורך של אזור מחקר זה, פותחה שיטה שבה ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזה (NHF-ATP) (איור 1) שימש תחליף כדי לדמיין את ההפנמה של ATP ולבחון את הלוקליזציה המרחבית התארית של ATP מופנם, הן במבחנה והן ב- vivo11,12 . NHF-ATP הוכח כתחליף ATP אנדוגני לחקור את תנועת ATP על פני קרום התא של בעלי חיים, הן בקווי תאים סרטניים והן ברקמת הגידול האנושית xenografted על עכברים חיסוניים11,12. יתר על כן, מתן מעכבי macropinocytosis לתאים חסם הפנמה eATP, דבר המצביע על כך ספיגה תאית של eATP כרוך מנגנון מקרופינוציטוטי9,11,12. פרוטוקול זה מאפשר חיסון קולבל נגד חלבונים ספציפיים לתא ובכך זיהוי של איזה סוג תא מפנים NHF-ATP. באמצעות קסנוגרפטים של גידול ויוו ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, ניתן לדמיין את NHF-ATP באופן מרחבי על פני דגימת הרקמה ואפילו בתוך תא אחד. שיטות אלה מאפשרות גם ניתוח כמותי, כגון אחוז ספיגת התאים, מספר שלל מקרופינוציטוטי וקינטיקה של הפנמה. מאמר זה מתאר בפירוט כיצד NHF-ATP, עובד לבד או יחד עם אנדוציטוזיס-tracer דקסטרנסים פלואורסצנטיים13,14,15,16, ניתן להשתמש בהגדרות ניסיוניות שונות כדי ללמוד הפנמה של ATP ולוקליזציה תאית, לאחר הפנמה בתאים.
איור 1: מבנים של ATP פלואורסצנטי בלתי ניתן להידור וטטראמתיל-רודמין המסומנים במשקל מולקולרי גבוה של דקסטרן פלואורסצנטי. (A)מבנה של NHF-ATP. (B)ייצוג סכמטי של HMWFD. קיצורים: ATP = אדנוסין טריפוספט; NHF-ATP = ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזל; TMR = טטרם אתילרודמין; HMWFD = משקל מולקולרי גבוה דקסטרן פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פותחה שיטה לניתוח מרחבי, זמני וכמותי של הפנמה תאית של ATP שאינו הידרוליזליזה. שיטה זו ישימה באופן נרחב לשימוש במערכות ביולוגיות מגוונות, לרבות מודלים גידוליים שונים, אשר עבורם אנו מספקים הדרכה טכנית ונתונים מייצגים. כדי להשיג נתונים הניתנים לפרשנות במהלך מחקרי הפנמת ATP של vivo (סעיף 4 של ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ההקפאה בוצעה באתר בליבת ההיסטופתולוגיה של אוניברסיטת אוהיו. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות סטארט-אפ (המכללה לאמנויות ומדעים של אוניברסיטת אוהיו) ל- C Nielsen; מענק NIH R15 CA242177-01 ופרס RSAC ל X חן.
Materials
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker – orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical – sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
Riferimenti
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
