Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

Summary

Dette papir giver en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitter ved temperaturer så høje som 70 ° C, inden nedfrysning til cryo-EM-eksperimenter.

Abstract

Prøvegitterene til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles normalt ved en temperatur, der er optimal til opbevaring af biologiske prøver, for det meste ved 4 °C og lejlighedsvis ved stuetemperatur. For nylig opdagede vi, at proteinstrukturen løst ved lav temperatur muligvis ikke er funktionelt relevant, især for proteiner fra termofile arkæer. Der blev udviklet en procedure til fremstilling af proteinprøver ved højere temperaturer (op til 70 °C) til cryo-EM-analyse. Vi viste, at strukturerne fra prøver fremstillet ved højere temperaturer er funktionelt relevante og temperaturafhængige. Her beskriver vi en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitre ved høj temperatur ved hjælp af 55 °C som eksempel. Forsøget gjorde brug af et forglasningsapparat modificeret ved hjælp af et yderligere centrifugerør, og prøverne blev inkuberet ved 55 °C. De detaljerede procedurer blev finjusteret for at minimere dampkondensation og opnå et tyndt lag is på gitteret. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter gives.

Introduction

Kryo-EM-teknologien til løsning af strukturerne i proteinkomplekser er fortsat med at blive forbedret, især i retning af at opnå strukturer med høj opløsning ^1,2. I mellemtiden er landskabet for dets anvendelse også blevet udvidet ved at variere prøvebetingelserne såsom pH eller ligander forud for forglasningsprocessen³, hvilket indebærer forberedelse af prøvegitter efterfulgt af springfrysning ^4,5. En anden vigtig betingelse er temperaturen. Selvom cryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, udføres ved lave temperaturer, afspejler strukturen løst af cryo-EM strukturen ved opløsningstilstanden før vitrifikation. Indtil for nylig bruger størstedelen af enkeltpartikelanalyse (SPA) cryo-EM-undersøgelser prøver, der opbevares på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifikation⁶, selvom en række undersøgelser bruger prøver ved omkring stuetemperatur 7,8,9,10 eller så højt som 42 ° C ¹¹. I en nylig rapport udførte vi temperaturafhængige undersøgelser af enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile arkæon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskellige temperaturer fra 4 °C til 70 °C¹². Vores undersøgelser tyder på, at det er vigtigt at forberede prøvegitter ved funktionelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metode, der er praktisk mulig til at løse strukturen af det samme proteinkompleks ved flere temperaturer.

Den største vanskelighed ved forglasning ved høje temperaturer er at minimere dampkondensation og opnå tynd is. Her rapporterer vi den detaljerede protokol, der blev brugt til fremstilling af prøvegitter ved høje temperaturer i vores tidligere undersøgelse af Sso-KARI ¹². Vi antager, at læserne eller seerne allerede har erfaring med den samlede prøveforberedelse og databehandlingsprocedurer for cryo-EM-eksperimenter og understreger de aspekter, der er relevante for høj temperatur.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol sigter mod at anvende et modificeret kommercielt vitrifikationsapparat til at forberede kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prøver ved specifikke temperaturer, især højere end 37 ° C. Den samlede forsøgsopstilling er vist i figur 1. Protokollen bruger 55 °C som eksempel. For de særlige forhold ved andre temperaturer henvises til supplerende tabel 2 i reference12. 1. Fremstilling af forglasningsapparatet <…

Representative Results

Oversigten over lav forstørrelse er vist i figur 5A,B. Panel A er et eksempel på et vellykket gitter. Der er en isgradient fra øverst til venstre (tykkere) til nederst til højre (tyndere eller tom). Et sådant gitter gør det lettere at finde en passende tykkelse af islaget i det midterste område, der er egnet til dataindsamling, såsom de blå og grønne kasser. Gitteret B er for tørt. Firkanterne i gitteret har lys kontrast, hvilket betyder, at islaget er for tyndt, …

Discussion

I trin 1 i protokollen skal du sørge for, at centrifugerøret er installeret godt og ikke falder, når eksperimentet er i gang. På grund af akkumuleringen af et stort antal vanddråber i kammeret, som kan ændre filterpapirets adsorptionskapacitet, anbefales det, at eksperimentets samlede tid ikke overstiger 30 minutter efter, at vitrifikationsapparatets kammer nåede ligevægtstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, skal operatøren udskifte filterpapiret og vente på, at kabinen balancerer temperatur o…

Materials

Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500