Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

Summary

Dette papiret gir en detaljert protokoll for å forberede prøvegitter ved temperaturer så høye som 70 ° C, før dypping for kryo-EM-eksperimenter.

Abstract

Prøvegitterene for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles vanligvis ved en temperatur som er optimal for lagring av biologiske prøver, hovedsakelig ved 4 ° C og noen ganger ved romtemperatur. Nylig oppdaget vi at proteinstrukturen løst ved lav temperatur kanskje ikke er funksjonelt relevant, spesielt for proteiner fra termofil archaea. En prosedyre ble utviklet for å forberede proteinprøver ved høyere temperaturer (opptil 70 ° C) for kryo-EM-analyse. Vi viste at strukturene fra prøver fremstilt ved høyere temperaturer er funksjonelt relevante og temperaturavhengige. Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av prøvegitter ved høy temperatur, med 55 °C som eksempel. Forsøket benyttet et vitrifikasjonsapparat modifisert ved hjelp av et ekstra sentrifugerør, og prøver ble inkubert ved 55 °C. De detaljerte prosedyrene ble finjustert for å minimere dampkondens og oppnå et tynt lag med is på rutenettet. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter er gitt.

Introduction

Kryo-EM-teknologien for å løse strukturene til proteinkomplekser har fortsatt å forbedre seg, spesielt i retning av å oppnå høyoppløselige strukturer ^1,2. I mellomtiden har landskapet av applikasjonen også blitt utvidet ved å variere prøveforholdene som pH eller ligander før vitrifiseringsprosessen³, som innebærer fremstilling av prøvegitter etterfulgt av stupfrysing ^4,5. En annen viktig betingelse er temperaturen. Selv om kryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, utføres ved lave temperaturer, reflekterer strukturen løst av cryo-EM strukturen ved løsningstilstanden før vitrifisering. Inntil nylig bruker flertallet av kryo-EM-studier (Single Particle Analysis) prøver som holdes på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifisering⁶, selv om en rekke studier bruker prøver ved rundt romtemperatur 7,8,9,10 eller så høyt som 42 ° C ¹¹. I en fersk rapport utførte vi temperaturavhengige studier av enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskjellige temperaturer fra 4 ° C til 70 ° C¹². Våre studier tyder på at det er viktig å forberede prøvegitter ved funksjonelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metoden som er praktisk gjennomførbar for å løse strukturen til det samme proteinkomplekset ved flere temperaturer.

Den største vanskeligheten for vitrifisering ved høye temperaturer er å minimere dampkondens og oppnå tynn is. Her rapporterer vi den detaljerte protokollen som ble brukt til å forberede prøvenett ved høye temperaturer i vår tidligere studie av Sso-KARI ¹². Vi antar at leserne eller seerne allerede har erfaring med de generelle prøvepreparerings- og databehandlingsprosedyrene for kryo-EM-eksperimenter og legger vekt på aspektene som er relevante for høy temperatur.

Protocol

MERK: Denne protokollen tar sikte på å bruke et modifisert kommersielt vitrifikasjonsapparat for å forberede kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prøvene ved bestemte temperaturer, spesielt høyere enn 37 ° C. Det samlede eksperimentelle oppsettet er vist i figur 1. Protokollen bruker 55 °C som eksempel. For de spesifikke forholdene ved andre temperaturer, se tilleggstabell 2 i referanse12. 1. Klargjøring av vitrifikasjonsapparatet <…

Representative Results

Oversikten over lav forstørrelse er vist i figur 5A,B. Panel A er et eksempel på et vellykket rutenett. Det er en isgradient fra øverst til venstre (tykkere) til nederst til høyre (tynnere eller tom). Et slikt rutenett gjør det lettere å finne en passende tykkelse på islaget i midtområdet som er egnet for datainnsamling, for eksempel de blå og grønne boksene. Rutenettet B er for tørt. Rutene i rutenettet har lys kontrast, noe som betyr at islaget er for tynt eller…

Discussion

I trinn 1 i protokollen må du kontrollere at sentrifugerøret er installert godt og ikke faller når eksperimentet pågår. På grunn av akkumulering av et stort antall vanndråper i kammeret, noe som kan endre adsorpsjonskapasiteten til filterpapiret, anbefales det at den totale tiden for forsøket ikke overstiger 30 minutter etter at vitrifikasjonsapparatkammeret nådde likevektstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, må operatøren bytte filterpapir og vente på at hytta balanserer temperatur og fukti…

Materials

Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500