Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software
Summary
Wir präsentieren ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll mit Durchlichtmikroskopie-Techniken, um Bilder zu erfassen, die Wachstumskinetik des filamentösen Pilzes A. nidulans sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann in Verbindung mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.
Abstract
Es ist gut bekannt, dass das Koloniewachstum von filamentösen Pilzen, das hauptsächlich von Veränderungen der hyphen/ myzelen apikalen Wachstumsrate abhängt, makroskopisch auf erstarrten Medien durch Vergleich der Koloniegröße geschätzt wird. Die Wachstumsrate genetisch unterschiedlicher Pilzstämme oder -stämme unter verschiedenen Umwelt-/Wachstumsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Antibiotika usw.) quantitativ zu messen, ist jedoch eine Herausforderung. Daher wird die Verfolgung komplementärer Ansätze zur Quantifizierung der Wachstumskinetik obligatorisch, um das Wachstum von Pilzzellen besser zu verstehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass filamentöse Pilze, einschließlich Aspergillus spp., unter Bedingungen unter der Luft auf festen Medien oder untergetauchten Kulturen unterschiedliche Wachstums- und Differenzierungsmodi aufweisen. Hier beschreiben wir eine quantitative mikroskopische Methode zur Analyse der Wachstumskinetik des Modellpilzes Aspergillus nidulansunter Verwendung von Live-Bildgebung sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien. Wir erfassen Bilder, analysieren und quantifizieren Wachstumsraten verschiedener Pilzstämme reproduzierbar und zuverlässig mit einer Open-Source-Software für Biobilder (z. B. Fidschi), und zwar auf eine Weise, die keine vorherige Bildanalyse-Expertise des Benutzers erfordert.
Introduction
Fadenförmige Pilze sind von großer sozioökonomischer und ökologischer Bedeutung, da sie sowohl als industrielle/landwirtschaftliche Werkzeuge für die Enzym- und Antibiotikaproduktion1,2 als auch als Krankheitserreger von Kulturpflanzen3,Schädlingsinsekten4 und Menschen3von entscheidender Bedeutung sind. Darüber hinaus werden filamentöse Pilze wie Aspergillus nidulans häufig als Modellorganismen für die Grundlagenforschung verwendet, wie z.B. Studien in Genetik, Zell- und Evolutionsbiologie sowie für die Untersuchung der Hyphenverlängerung5. Filamentöse Pilze sind hochpolarisierte Organismen, die sich durch die kontinuierliche Versorgung mit Membranlipiden/Proteinen und die De-novo-Synthese der Zellwand an der ausdehnenden Spitze6 verlängern. Eine zentrale Rolle beim Wachstum der Hyphenspitze und der Aufrechterhaltung der Polarität ist eine spezialisierte Struktur namens “Spitzenkorper” (SPK), eine hochgeordnete Struktur, die hauptsächlich aus zytoskelettalen Komponenten und der polarisierten Verteilung des Golgi6,7,8besteht .
Umweltreize/-signale, wie Wasser-Luft-Grenzfläche, Licht, CO2-Konzentration und der Ernährungszustand sind für die Entwicklungsentscheidungen dieser Schimmelpilze verantwortlich9. In untergetauchten (flüssigen) Kulturen wird die Differenzierung von A. nidulans unterdrückt und das Wachstum erfolgt durch Hyphenspitzendehnung6. Während des vegetativen Wachstums keimen asexuelle Sporen (Konidien) durch apikale Ausdehnung und bilden ein undifferenziertes Netzwerk von miteinander verbundenen Hyphenzellen, dem Myzel, das unbegrenzt weiter wachsen kann, solange Nährstoffe und Platz verfügbar sind. Zum anderen verlängern sich auf festen Medienhypenspitzen und nach einer definierten Periode vegetativen Wachstums (Entwicklungskompetenz) wird die asexuelle Fortpflanzung eingeleitet und luftbildende Konidiophorstiele erstrecken sich aus spezialisierten Fußzellen des Myzels6. Diese führen zu spezialisierten entwicklungsübergreifenden mehrzelligen Strukturen, den sogenannten Konidiophoren, die lange Ketten haploider Konidien10 produzieren, die das Wachstum unter günstigen Umweltbedingungen wieder aufnehmen können.
Eine weit verbreitete Methode zur Messung des filamentösen Pilzwachstums besteht darin, Sporen auf Nährstoffagar in einer Petrischale zu impfen und einige Tage später den Durchmesser der Kolonie makroskopisch zu messen11. Der Durchmesser / die Fläche der Kolonie, die am meisten von Veränderungen der Myzelwachstumsrate und weniger von der Konidiophordichte12abhängt, wird dann als Wachstumswert verwendet. Obwohl die Messung der Pilzpopulation (Kolonie) auf festen Oberflächen durchaus ausreichend ist, ist sie keineswegs das genaueste Maß für das Wachstum. Im Vergleich zu Durchschnittswerten auf Populationsebene (Durchschnittswerte der Pilzkoloniegröße) können Einzelzellmessungen die Heterogenität einer Zellpopulation erfassen und die Identifizierung neuartiger Subpopulationen von Zellen,Zuständen 13,Dynamik, Signalwegen sowie den biologischen Mechanismen ermöglichen, mit denen Zellen auf endogene und Umweltveränderungen reagieren14,15. Die Überwachung des Pilzzellwachstums und des Phänotyps durch Zeitraffermikroskopie ist wohl der am weitesten verbreitete quantitative Einzelzellbeobachtungsansatz.
Hierin beschreiben wir ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll unter Verwendung von Durchlichtmikroskopietechniken (wie Phasenkontrast, differentialer Interferenzkontrast (DIC) und polarisierter Mikroskopie) zur Aufnahme von Bildern, die unabhängig von der kombinierten Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse und Quantifizierung des polaren Wachstums von A. nidulans-Stämmen sowohl in untergetauchten Kulturen als auch in festen Medien verwendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Überwachung des Pilzzellwachstums und des Phänotyps mittels Zeitraffermikroskopie ist ein leistungsfähiger Ansatz, um das zelluläre Verhalten in Echtzeit zu beurteilen und quantitativ und genau zu bestimmen, ob eine bestimmte medikamentöse Behandlung und / oder genetische Intervention zu nachweisbarem Zellwachstum oder phänotypischen Unterschieden im Laufe der Zeit führt.
In dieser Studie wurde eine zuverlässige Methode der Lebendzellbildgebung beschrieben, um die Pilzentwicklung z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch das Projekt “A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) unterstützt, das im Rahmen der Aktion “Stärkung der Forschungs- und Innovationsinfrastruktur” durchgeführt wird, finanziert durch das operationelle Programm “Wettbewerbsfähigkeit, Unternehmertum und Innovation” (NSRP 2014-2020) und kofinanziert von Griechenland und der EU.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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