Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen
Summary
Dieser Artikel stellt eine einzigartige Methode zur Analyse von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen unter Verwendung eines neuartigen Darmorgankultursystems für Ex-vivo-Experimente vor.
Abstract
Die Struktur des Darmgewebes ermöglicht enge und mutualistische Interaktionen zwischen dem Wirt und der Darmmikrobiota. Diese Gespräche sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der lokalen und systemischen Homöostase; Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota (Dysbiose) sind mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten verbunden. Methoden zur Sezierung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen umfassen einen inhärenten Kompromiss zwischen der Erhaltung der physiologischen Gewebestruktur (bei Verwendung von In-vivo-Tiermodellen) und dem Grad der Kontrolle über die Versuchsfaktoren (wie in einfachen In-vitro-Zellkultursystemen). Um diesen Kompromiss anzugehen, haben Yissachar et al. kürzlich ein Darmorgankultursystem entwickelt. Das System bewahrt eine naive Dickdarmgewebekonstruktion und zelluläre Mechanismen und ermöglicht auch eine strenge experimentelle Kontrolle, was Experimente erleichtert, die in vivonicht ohne weiteres durchgeführt werden können. Es ist optimal für die Sezierung kurzfristiger Reaktionen verschiedener Darmkomponenten (wie epitheliale, immunologische und neuronale Elemente) auf luminale Störungen (einschließlich anaerober oder aerober Mikroben, ganzer Mikrobiotaproben von Mäusen oder Menschen, Medikamenten und Metaboliten). Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung eines optimierten Protokolls für die Organkultur mehrerer Darmfragmente mit einem maßgeschneiderten Darmkulturgerät. Wirtsreaktionen auf luminale Störungen können durch Immunfluoreszenzfärbung von Gewebeabschnitten oder Gewebefragmenten ganzer Montierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder Zeitrafferbildgebung sichtbar gemacht werden. Dieses System unterstützt eine Vielzahl von Auslesungen, einschließlich Next-Generation-Sequenzierung, Durchflusszytometrie und verschiedene zelluläre und biochemische Assays. Insgesamt unterstützt dieses dreidimensionale Organkultursystem die Kultur von großem, intaktem Darmgewebe und hat breite Anwendungen für die hochauflösende Analyse und Visualisierung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen in der lokalen Darmumgebung.
Introduction
Der Darm ist ein hochkomplexes Organ, das eine breite Palette von Zelltypen (Epithelzellen, Zellen des Immunsystems, Neuronen und mehr) enthält, die in einer bestimmten Struktur organisiert sind, die es den Zellen ermöglicht, miteinander und mit dem Luminalgehalt (Mikrobiota, Nahrung usw.) zu interagieren und zu kommunizieren. 1.Derzeit umfasst die Forschungs-Toolbox, die für die Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen zur Verfügung steht, In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Tiermodelle 2. In-vivo-Tiermodelle bieten eine physiologische Gewebekonstruktion3, jedoch mit schlechter experimenteller Kontrolle und begrenzter Fähigkeit, die Versuchsbedingungen zu manipulieren. In-vitro-Kultursysteme hingegen verwenden Primärzellen oder Zelllinien, die mit Mikroben4ergänzt werden können und eine strenge Kontrolle über die Experimentparameter bieten, aber die zelluläre Komplexität und die Gewebearchitektur fehlen. Moderne In-vitro-Assays ermöglichen die fortgeschrittene Verwendung gesunder und pathologischer menschlicher Gewebeproben, wie Epithelorganoide aus Maus- oder menschlichen Quellen5,6und Proben, die die Schleimhautmikroumgebung nachahmen7. Ein weiteres Beispiel ist der “Gut on a Chip”-Assay, der die menschliche Kolonepithelzelllinie (Caco2), die extrazelluläre Matrix und mikrofluidische Kanäle umfasst, um den physiologischen Zustand der Darminvariante nachzuahmen8. So fortschrittlich und innovativ In-vitro-Proben auch sein mögen, sie behalten jedoch keine normale Gewebearchitektur oder naive Zellzusammensetzung bei.
Um dies zu beheben, haben Yissachar et al. kürzlich ein ex vivo Organkultursystem9 (Abbildung 1) entwickelt, das intakte Darmfragmente ex vivoaufrechterhält und von den Vorteilen sowohl in vivo als auch in vitro Modellen profitiert. Dieses Ex-vivo-Darmorgankultursystem basiert auf einem maßgeschneiderten Kulturgerät, das eine multiplexierte Kultur von sechs Dickdarmgeweben unterstützt, so dass experimentelle Inputs unter vergleichbaren Bedingungen untersucht und gleichzeitig die Ein- und Ausgänge des Systems gesteuert werden können. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass dieses System für die Analyse von Darmreaktionen auf einzelne Darmbakterien9, ganze menschliche Mikrobiotaproben10 und mikrobielle Metaboliten11wertvoll ist. Dieses System ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung dieser frühen Wirt-Mikrobiota-Interaktionen mit einem hohen Maß an Kontrolle über die Wirts-, Mikrobien- und Umweltkomponenten. Darüber hinaus ermöglicht es die Überwachung und Manipulation des Systems während des gesamten Experiments in Echtzeit.
Abbildung 1: Schemata der Darmkulturvorrichtung. Ein ganzes Darmgewebefragment ist an den Ausgangs- und Eingangsanschlüssen der Kammer (oben) befestigt, wobei Pumpen den Medienfluss innerhalb des Lumens und in der externen Mediumkammer regulieren. Das gesamte Gerät (unten) enthält 6 solcher Kammern. Diese Zahl wurde von Yissachar et al. 2017 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt ein optimiertes Protokoll für Ex-vivo-Darmorgankulturen, das Yissachar et al. kürzlich entwickelt haben (veröffentlichte9 und unveröffentlichte Daten). Das Darmorgankultursystem unterstützt die multiplexierte Kultur intakter Darmfragmente bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des Luminalflusses. Es bietet die volle Kontrolle über die intra- und extralumnale Umgebung (einschließlich Stimulationsdosis, Expositionszeit und Durchflussrate) und bewahrt die naive…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Yissachar-Labors für ihre wertvollen Beiträge zur Optimierung des Protokolls des Darmorgankultursystems. Wir danken Yael Laure für die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (Förderkennzeichen 3114831), der Israel Science Foundation – Broad Institute Joint Program (Zuschuss Nr. 8165162) und dem Gassner Fund for Medical Research, Israel, unterstützt.
Materials
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
Riferimenti
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