宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム
Summary
本稿では、新しい腸器官培養システムを用いて、 生体 実験を行うホストとマイクロバイオームの相互作用を分析する独自の方法を紹介する。
Abstract
腸組織の構造は、宿主と腸内微生物叢との間の密接かつ相互的な相互作用を促進する。これらのクロストークは、局所的および全身的な恒常性を維持するために重要です。腸内微生物叢組成(ジスビオシス)の変化は、幅広いヒト疾患に関連する。宿主-微生物叢相互作用を解剖する方法には、生理学的組織構造の保存( 生体内 動物モデルを使用する場合)と実験因子の制御レベル(単純な インビトロ 細胞培養システム)の間の固有のトレードオフが含まれます。このトレードオフに対処するために、Yissacharらは最近、腸管臓器培養システムを開発した。このシステムは、素朴な結腸組織構造および細胞機構を維持し、また、緊密な実験的制御を可能にし、 生体内で容易に行うことができない実験を促進する。これは、様々な腸成分(上皮、免疫、神経要素など)の発光摂動(嫌気性または好気性微生物、マウスまたはヒト、薬物および代謝産物からの全微生物叢サンプルを含む)の短期的な応答を解剖するのに最適です。ここでは、カスタムメイドの腸培養装置を用いて、複数の腸管断片の器官培養に最適化されたプロトコルの詳細な説明を提示する。発光摂動に対する宿主応答は、組織切片または全実装組織断片の免疫蛍光染色、蛍光インザビトゥーハイブリダイゼーション(FISH)、またはタイムラプスイメージングによって可視化することができる。次世代シーケンシング、フローサイトメトリー、各種細胞・生化学的アッセイなど、幅広い読み出しをサポートします。全体として、この3次元の器官培養システムは、大規模で無傷の腸組織の培養をサポートし、局所的な腸内環境における宿主微生物叢相互作用の高解像度分析および視覚化のための広範な用途を有する。
Introduction
腸は、細胞が相互に相互作用し、相互に通信することを可能にする特定の構造で組織された細胞タイプ(上皮細胞、免疫系細胞、ニューロンなど)の広い範囲を含む非常に複雑な器官であり、発光含有量(微生物叢、食物など)1.現在、宿主-微生物叢相互作用を分析するために利用可能な研究ツールボックスには、生体外細胞培養と生体内動物モデル2が含まれる。生体内動物モデルは生理的組織構造3を提供するが、実験制御が不十分であり、実験条件を操作する能力が限られている。一方、インビトロ培養システムは、微生物4を補うことができる一次細胞または細胞株を使用し、実験パラメータを厳密に制御するが、細胞の複雑さと組織アーキテクチャを欠いている。現代のin vitroアッセイは、マウスまたはヒト源由来の上皮オルガノイドのような健康で病理学的なヒト組織サンプルの高度な使用を可能にする。もう一つの例は、ヒト大腸上皮細胞株(Caco2)、細胞外マトリックスおよび微小流体チャネルを含む「チップ上の腸」アッセイであり、腸不変8の生理学的状態を模倣する。しかし、in vitroサンプルのように高度かつ革新的であるように、それらは正常な組織アーキテクチャまたはナイーブな細胞組成を維持しない。
その問題に対処するために、Yissacharらの開発は、インビボモデルとインビトロモデルの両方の利点から恩恵を受け、インタクトな腸の断片を維持するex vivo器官培養システム9(図1)を最近開発した。 このex vivo腸臓器培養システムは、6つの大腸組織の多重化培養をサポートするカスタムメイドの培養装置に基づいており、システムの入力と出力を制御しながら、同等の条件下で実験的入力を調べることができます。最近の研究では、このシステムが個々の腸内細菌9、ヒト微生物叢サンプル10および微生物代謝産物11に対する腸内応答を分析するのに有用であることを実証した。このシステムは、初めて、宿主、微生物および環境成分に対する高いレベルの制御を伴うこれらの初期の宿主微生物叢相互作用の研究を可能にする。さらに、リアルタイムで、実験全体を通してシステムを監視し、操作することができます。
図1: 腸管培養装置の概略図 腸組織全体の断片は、チャンバー(上)の出力および入力ポートに取り付けられ、ポンプは内腔内および外部媒体室内の媒体流れを調節する。全体の装置(底部)は6つのそのような部屋を含んでいる。この図は、2017年のYissacharらから変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、Yissacharらの最近開発した ex vivo 腸器官培養に最適化されたプロトコルについて説明します(9 および未公開データを公開)。腸器官培養システムは、発光の流れを維持しながら、無傷の腸断片の多重化培養をサポートする。それは、イントラおよび超発光環境(刺激用量、暴露時間および流量を含む)を完全に制御し、ナイーブな腸組織構造とその細胞複雑?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yissacharラボの過去および現在のメンバーに感謝し、腸臓器培養システムプロトコルの最適化に貢献しました。原稿の批判的な編集に対して、ヤエル・ローレに感謝します。この研究は、イスラエル科学財団(助成金第3114831)、イスラエル科学財団 – ブロードインスティテュート共同プログラム(助成金8165162)、ガズナー医学研究基金(イスラエル)によって支援されました。
Materials
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
Riferimenti
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
