Система культуры органов кишечника для анализа взаимодействия хозяина и микробиоты
Summary
В этой статье представлен уникальный метод анализа взаимодействий хозяина и микробиома с использованием новой системы культуры органов кишечника для экспериментов ex vivo.
Abstract
Структура ткани кишечника способствует тесному и взаимному взаимодействию между хозяином и кишечной микробиотой. Эти перекрестные переговоры имеют решающее значение для поддержания местного и системного гомеостаза; изменения в составе микробиоты кишечника (дисбактериоз) связаны с широким спектром заболеваний человека. Методы препарирования взаимодействий хозяина и микробиоты включают в себя неотъемлемый компромисс между сохранением физиологической структуры ткани (при использовании животных моделей in vivo) и уровнем контроля над факторами эксперимента (как в простых системах культивирования клеток in vitro). Чтобы устранить этот компромисс, Yissachar et al. недавно разработали систему культуры кишечных органов. Система сохраняет наивную конструкцию ткани толстой кишки и клеточные механизмы, а также позволяет осуществлять жесткий экспериментальный контроль, облегчая эксперименты, которые не могут быть легко выполнены in vivo. Он оптимален для рассечения кратковременные реакции различных компонентов кишечника (таких как эпителиальные, иммунологические и нейронные элементы) на просветные возмущения (включая анаэробные или аэробные микробы, образцы целой микробиоты от мышей или людей, лекарства и метаболиты). Здесь мы представляем подробное описание оптимизированного протокола для культуры органов из нескольких фрагментов кишечника с использованием специально изготовленного устройства для культивации кишечника. Реакции хозяина на люминальные возмущения могут быть визуализированы иммунофлуоресцентным окрашиванием участков ткани или фрагментов ткани целиком, флуоресцентной гибридизацией in-situ (FISH) или покадровой визуализацией. Эта система поддерживает широкий спектр считывания, включая секвенирование следующего поколения, проточную цитометрию и различные клеточные и биохимические анализы. В целом, эта трехмерная система культуры органов поддерживает культуру больших, интактных тканей кишечника и имеет широкое применение для анализа высокого разрешения и визуализации взаимодействий хозяина и микробиоты в местной кишечной среде.
Introduction
Кишечник является очень сложным органом, содержащим широкий спектр типов клеток (эпителиальные клетки, клетки иммунной системы, нейроны и т. Д.), Организованный в определенную структуру, которая позволяет клеткам взаимодействовать и общаться друг с другом и с содержанием просвета (микробиота, пища и т. Д.). 1. В настоящее время исследовательский инструментарий, доступный для анализа взаимодействий хозяина и микробиоты, включает в себя культуры клеток in vitro и модели животных in vivo 2. Животные модели in vivo обеспечивают физиологическую тканевую конструкцию3, но с плохим экспериментальным контролем и ограниченной способностью манипулировать условиями эксперимента. Системы культивирования in vitro, с другой стороны, используют первичные клетки или клеточные линии, которые могут быть дополнены микробами4,предлагая жесткий контроль над параметрами эксперимента, но не имея клеточной сложности и архитектуры тканей. Современные анализы in vitro позволяют использовать расширенные образцы здоровых и патологических тканей человека, такие как эпителиальные органоиды, полученные из мышиных или человеческих источников5,6,и образцы, которые имитируют микросреду слизистой оболочки7. Другим примером является анализ «кишечник на чипе», который включает в себя эпителиальную клеточную линию толстой кишки человека (Caco2), внеклеточный матрикс и микрофлюидные каналы для имитации физиологического состояния инварианта кишечника8. Однако, какими бы продвинутыми и инновационными ни были образцы in vitro, они не поддерживают нормальную тканевую архитектуру или наивный клеточный состав.
Чтобы решить эту проблему, Yissachar et al. недавно разработали систему культуры органов ex vivo 9 (рисунок 1),которая поддерживает неповрежденные фрагменты кишечника ex vivo,извлекая выгоду из преимуществ моделей как in vivo, так и in vitro. Эта система культивирования органов кишечника ex vivo основана на специально изготовленном устройстве для культивирования, которое поддерживает мультиплексированную культуру шести тканей толстой кишки, позволяя исследовать экспериментальные входы в сопоставимых условиях, контролируя входы и выходы системы. Недавние работы продемонстрировали, что эта система ценна для анализа кишечных реакций на отдельные кишечные бактерии9,образцы всей микробиоты человека10 и микробные метаболиты11. Эта система позволяет впервые изучать эти ранние взаимодействия хозяин-микробиота с высоким уровнем контроля над компонентами хозяина, микробами и окружающей средой. Кроме того, он позволяет контролировать и манипулировать системой на протяжении всего эксперимента в режиме реального времени.
Рисунок 1:Схемы устройства кишечной культуры. Целый фрагмент кишечной ткани прикрепляется к выходному и входному портам камеры (верхней), с насосами, регулирующими поток среды внутри просвета и во внешней средней камере. Все устройство (днище) содержит 6 таких камер. Эта цифра была изменена с Yissachar et al. 2017. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается оптимизированный протокол для культур органов кишечника ex vivo, который недавно разработали Yissachar et al. (опубликованные9 и неопубликованные данные). Система культуры органов кишечника поддерживает мультиплексированную культуру неповрежденных …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим бывших и нынешних членов лаборатории Иссахара за их ценный вклад в оптимизацию протокола системы культуры органов кишечника. Мы благодарим Яэль Лор за критическое редактирование рукописи. Эта работа была поддержана Израильским научным фондом (грант No 3114831), Совместным фондом израильского научного фонда – Института Броуда (грант No 8165162) и Фондом медицинских исследований Гасснера, Израиль.
Materials
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
Riferimenti
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
