BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi
Summary
Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde, sürdürülmesinde ve değiştirilmesinde çok önemli bir rol oynadıkları için hücrelerdeki tüm biyolojik süreçlerin ayrılmaz bir parçasıdır. Bu etkileşimler sinyal transdüksiyon, patojen yanıtı, hücre-hücre etkileşimleri, metabolik ve gelişimsel süreçler gibi çok çeşitli fenomenlerde yer almaktadır. Transkripsiyon faktörleri söz konusu olduğunda, bu etkileşimler alt ünüllerin oligomerizasyonuna, çekirdek, sitoplazma vb. Burada, Floresan Ömür Boyu Görüntülemeyi (FLIM) içeren Bimoleküler Floresan Kompleasyonu (BiFC) tabanlı Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak in vivo üçlü etkileşimi görselleştirmek için bir metodoloji sunuyoruz. Bu gösteri için seçilen proteinlerden ikisi BiFC ortağı olarak etkileşime girer ve yeniden inşa edilen floresan aktiviteleri üçüncü ortakla FRET-FLIM’i test etmek için kullanılır. Dört ila beş haftalık büyüme odası tarafından yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkileri bu gösteri için model bitki sistemi olarak kullanılmıştır.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (PPI’ler) çeşitli metabolik ve gelişimsel süreçleri düzenleyerek ökaryotik hücrelerin düzgün çalışmasının temelini oluşturur. Bazı PPI’lar kararlıdır, bazıları ise doğada geçicidir. Etkileşimler, dimerik, trimerik, tetramerik homomerik ve heteromerik1gibi etkileşimdeki üye sayısına ve türüne göre kategorize edilebilir. Protein etkileşimlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, protein fonksiyonlarının ve düzenleyici ağların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir.
Transkripsiyon faktörleri düzenleyici işlevlerde yer alan proteinlerdir. DNA’ya bağlanarak aşağı akış genlerinin transkripsiyon oranını düzenlerler. Bazen proteinler tarafından oligomerizasyon veya daha yüksek sıralı komplekslerin oluşumu, işlevlerini yerine getirmek için bir ön koşuldur2. Bitki MADS kutusu transkripsiyon faktörleri çiçek geçişi, çiçek organ gelişimi, gübreleme, tohum gelişimi, senescence ve vejetatif gelişim gibi çeşitli süreçleri düzenleyen homeotik genlerdir. DNA3,4‘e bağlanan daha yüksek sıralı kompleksler oluşturdukları bilinmektedir. Transkripsiyon faktörleri ve etkileşimcileri arasında ÜFE ağlarının incelenmesi, transkripsiyonsal düzenlemenin altında kalan karmaşıklık hakkında içgörüler sağlar.
Nicotiana benthamiana’da geçici protein ekspresyasyonu, protein lokalizasyonunu veya protein-protein etkileşimlerini incelemek için popüler bir yaklaşımolmuştur 5. BiFC ve FRET, floresan muhabir sistemlerini kullanarak in vivo protein-protein etkileşimlerini incelemek için yöntemlerdir6. Bu iki tekniğin bir kombinasyonunun üç protein arasındaki etkileşimi ortaya çıkardığı gösterilmiştir7. FRET, kabul edici fotobleaching, duyarlı emisyon ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (FLIM) tekniği kullanılarak ölçülür. FLIM tabanlı FRET tahlilleri, floresan ömürlerine göre iki molekül arasındaki enerji transferi ölçümlerine doğru nicelik ve mekansal özgüllük sağlayan bir araç olarak ortaya çıkmıştır8. FLIM, bir foton yaymadan önce bir flororforun heyecanlı bir durumda kaldığı zamanı ölçen ve sadece yoğunluk ölçümlerini kullanan tekniklerden daha iyidir9,10. Nicotiana benthamiana ve soğan epidermal peelingleri gibi heterolog sistemlerin yanı sıra, daha yeni raporlar, yerelkoşullaraltında protein-protein etkileşimlerinin in vivo analizi için Arabidopsis köklerinin ve genç pirinç fidelerininvb.
Uygun bir ifade sistemi dışında, BiFC ve FRET tahlilleri için etkileşime giren ortakların seçimi de bu deneyin başarısı için çok önemlidir. BiFC yapılandırmasında kullanılan ortaklar arasındaki ÜFE, FRET denemesinde eşleştirilmiş bir ortak olarak kullanılmadan önce uygun denetimler kullanılarak doğrulanmalıdır13. BiFC, floresan proteinin N ve C-terminal parçalarının yapısal tamamlayıcısını kullanır. BiFC tahlillerinde kullanılan tüm floresan proteinlerin çoğunda yaygın bir sınırlama, iki türev nonfluoresan parçası arasındaki kendi kendine montaj olmuştur, yanlış-pozitif floresanlara katkıda bulunur ve sinyal-gürültü (S / N) oranınıazaltır 14. Nokta mutasyonları veya floresan proteini bölme pozisyonu da dahil olmak üzere son gelişmeler, artan yoğunluk, daha yüksek özgüllük, yüksek S / N oranı15,16ile BiFC çiftlerine yol açtı. Bu floresan proteinler, deneyin uygunluğuna bağlı olarak BiFC’yi gerçekleştirmek için de kullanılabilir.
Geleneksel olarak, CFP ve YFP, FRET deneylerinde donör ve alıcı çift olarak kullanılmıştır17. Bununla birlikte, YFP veya m-Sitrin’in Arabidopsis kök sisteminde hedef proteinlerin doğal ekspresyumu sırasında yüksek kuantum verimi (QY) nedeniyle daha iyi FRET donörleri (kabul eden olarak RFP ile kullanıldığında) olduğu bulunmuştur. Organizatörlerin seçimi (konsitutive versus native/endogenous) ve fluorophore da başarılı bir BiFC-FRET-FLIM deneyi tasarlamada çok önemli bir rol oynamaktadır. FRET donörlerinin verimliliğinin ve FRET çiftlerinin uygunluğunun, organizatördeki değişiklik ve ifade için kullanılan biyolojik sistemle değişme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Parlaklığı ile ilgili floroforun QY’si pH’a, sıcaklığa ve kullanılan biyolojik sisteme bağlıdır. FRET deneyi için florofor çiftini seçmeden önce bu kriterlerin iyice dikkate alınmasını öneriyoruz. Bu protokol için kullanılan biyolojik sistem, promotörler ve proteinler BiFC FRET-FLIM deneyi için CFP-YFP floroforları ile iyi çalıştı.
Bu çalışmada, BiFC tabanlı FRET kullanarak üç protein molekülü arasındaki etkileşimi görselleştirmek için FLIM özelliğini birleştiriyoruz. Bu teknikte, iki protein bölünmüş YFP proteini ve üçüncü protein CFP ile etiketlenir. Mads kutusu protein (M) homodimerinin Kalsiyum sensör proteini (C) ile etkileşimini incelemek istediğimizden, bu proteinler pSITE-1CA ve pSITE-3CA vektörlerinde floresan proteinlerle etiketlenmiştir18. Etkileşime giren ortaklardan ikisi, bu testte, pSPYNE-35S ve pSPYCE-35S vektörlerinde YFP’nin N ve C-terminal parçaları ile etiketlenmiştir veetkileşimleri,CFP (FRET donörü olarak hareket eden) ile etiketlenen üçüncü etkileşim ortağına FRET kabul edicisi olarak hareket eden işlevsel YFP’nin yeniden birleşmesi ile sonuçlanır (Şekil 1 ). Bu özel durumda, iki M monomeri ile M ve C arasındaki PPI, BiFC’nin maya-iki-hibrid sistemle birlikte üç farklı sistemde gerçekleştirilmesiyle doğrulanmıştır. Bu vektörler elektroporasyon ile Agrobacterium tumifaciens GV3101 suşu içine harekete geçirildi. GV3101 suşu, gentamisin direnci20olan etkisiz hale tedaklı bir Ti plazmid pMP90’a (pTiC58DT-DNA) sahiptir. Transgene susturma önlemek için tüm infiltratyonlarla birlikte bir p19 Agrobacterium suşu eklendi21. Üç proteinin üçlü etkileşimleri doğrulamak için zıt konformasyonlarda da kullanılmasını öneririz.
Bu teknikte, ilk olarak, bağışçının floresan ömrünün (söndürülmemiş donör ömrü) bir alıcının yokluğunda ölçüldüğü FLIM’i çalıştırdık. Bundan sonra, ömrü alıcının varlığında ölçülür (söndürülen donör ömrü). Donör floresan ömürlerindeki bu fark, floresan ömründe bir azalma gösteren foton sayısına bağlı olan FRET verimliliğini hesaplamak için kullanılır. Aşağıda, Nicotiana benthamiana’daki floresan etiketli proteinleri geçici olarak ifade ederek ve BiFC-FRET-FLIM ile etkileşimlerini test ederek herhangi bir üç protein arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için ayrıntılı bir protokol verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, MADS kutu proteininin iki monomeri ile kalsiyum sensör proteini arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için BiFC tabanlı FRET-FLIM testinin kullanımını göstermektedir. Protokol, Y. John Shyu ve ark. tarafından hazırlanan ve Fos-Jun heterodimers ile NFAT veya p65 arasında oluşturulan üçlü kompleksi hassaslaştırılmış emisyon yöntemi7kullanarak görselleştirmek için BiFC tabanlı bir FRET yöntemi geliştirdikleri bir rapordan uyarlanmıştır. Dah…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC, üniversite hibe komisyonuna (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE ve Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi’ne (CSIR) araştırma bursları için içtenlikle teşekkür eder. Biyoteknoloji Departmanı (DBT), Hindistan Hükümeti, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (DST-FIST), Hindistan Hükümeti’ni finansal destek için çok şükür kabul ediyoruz.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
Riferimenti
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
