Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón
Summary
Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.
Abstract
Tanto las enfermedades cardíacas genéticas como las no genéticas pueden causar procesos de remodelación severos en el corazón. La remodelación estructural, como la deposición de colágeno (fibrosis) y la desalineación celular, puede afectar la conducción eléctrica, introducir disfunciones electromecánicas y, eventualmente, conducir a arritmias. Los modelos predictivos actuales de estas alteraciones funcionales se basan en información estructural no integrada y de baja resolución. Colocar este marco en un orden de magnitud diferente es un desafío debido a la ineficacia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución en tejido masivo. En este trabajo, describimos un marco metodológico que permite obtener imágenes de corazones de ratón enteros con resolución micrométrica. La consecución de este objetivo ha requerido un esfuerzo tecnológico donde se han combinado los avances en la transformación de tejidos y los métodos de imagen. Primero, describimos un protocolo CLARITY optimizado capaz de transformar un corazón intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite una alta transparencia y tinción profunda. Luego, se describe un microscopio de lámina de luz fluorescente capaz de adquirir rápidamente imágenes de un campo de visión mesoscópico (escala mm) con la resolución a escala micrométrica. Siguiendo el proyecto mesoSPIM, el microscopio concebido permite la reconstrucción de todo el corazón del ratón con resolución micrométrica en un solo escaneo tomográfico. Creemos que este marco metodológico permitirá aclarar la participación del desorden citoarquitectónico en las disfunciones eléctricas y allanar el camino para un modelo integral que considere tanto los datos funcionales como los estructurales, permitiendo así una investigación unificada de las causas estructurales que conducen a alteraciones eléctricas y mecánicas después de la remodelación tisular.
Introduction
La remodelación estructural asociada a enfermedades cardíacas puede afectar la conducción eléctrica e introducir disfunciones electromecánicas del órgano 1,2. Los enfoques actuales utilizados para predecir alteraciones funcionales comúnmente emplean MRI y DT-MRI para obtener una reconstrucción general de la deposición de fibrosis, el árbol vascular y la distribución de fibras del corazón, y se utilizan para modelar las rutas de propagación del potencial de acción preferencial (APP) a través del órgano 3,4. Estas estrategias pueden proporcionar una hermosa visión general de la organización del corazón. Sin embargo, su resolución espacial es insuficiente para investigar el impacto de la remodelación estructural en la función cardíaca a nivel celular.
Colocar este marco en un orden de magnitud diferente, donde las células individuales pueden desempeñar papeles individuales en la propagación del potencial de acción, es un desafío. La principal limitación es la ineficiencia de los métodos de imagen estándar para realizar imágenes de alta resolución (resolución micrométrica) en tejidos masivos (de tamaño centímetro). De hecho, la obtención de imágenes de tejidos biológicos en 3D a alta resolución es muy complicada debido a la opacidad del tejido. El enfoque más común para realizar reconstrucciones 3D en órganos enteros es preparar secciones delgadas. Sin embargo, la sección precisa, el ensamblaje y las imágenes requieren un esfuerzo y tiempo significativos. Un enfoque alternativo que no exige cortar la muestra es generar un tejido transparente. Durante los últimos años, se han propuesto varias metodologías para clarificar tejidos 5,6,7,8. El desafío de producir tejidos masivos, transparentes y marcados con fluorescencia se ha logrado recientemente mediante el desarrollo de verdaderos enfoques de transformación de tejidos (CLARITY9, SHIELD10). En particular, el método CLARITY se basa en la transformación de un tejido intacto en una forma nanoporosa, hibridada con hidrogel, libre de lípidos que permite conferir una alta transparencia mediante la eliminación selectiva de bicapas lipídicas de membrana. Cabe destacar que este método ha sido encontrado exitoso también en la preparación cardíaca11,12,13,14. Sin embargo, dado que el corazón es demasiado frágil para ser adecuado para una limpieza activa, debe limpiarse utilizando el enfoque pasivo, que requiere mucho tiempo para conferir una transparencia completa.
En combinación con técnicas avanzadas de imagen como la microscopía de hoja de luz, CLARITY tiene el potencial de obtener imágenes de tejidos cardíacos masivos en 3D a resolución micrométrica. En la microscopía de lámina de luz, la iluminación de la muestra se realiza con una lámina delgada de luz confinada en el plano focal del objetivo de detección. La emisión de fluorescencia se recoge a lo largo de un eje perpendicular al plano de iluminación15. La arquitectura de detección es similar a la microscopía de campo amplio, lo que hace que la adquisición sea mucho más rápida que los microscopios de barrido láser. El desplazamiento de la muestra a través de la lámina de luz permite obtener una tomografía completa de muestras grandes, de hasta un centímetro de tamaño. Sin embargo, debido a las propiedades intrínsecas del haz gaussiano, es posible obtener una lámina de luz muy delgada (del orden de unas pocas micras) solo para una extensión espacial limitada, lo que limita drásticamente el campo de visión (FoV). Recientemente, se ha introducido un novedoso esquema de excitación para superar esta limitación y se ha aplicado para imágenes cerebrales, permitiendo reconstrucciones 3D con resolución isotrópica16.
En este documento, se presenta un enfoque de compensación pasiva, lo que permite una reducción significativa del tiempo de compensación necesario para el protocolo CLARITY. El marco metodológico descrito aquí permite reconstruir un corazón de ratón completo con resolución micrométrica en una sola exploración tomográfica con un tiempo de adquisición del orden de minutos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, se introdujo un enfoque exitoso para limpiar, teñir e imaginar un corazón de ratón completo en alta resolución. En primer lugar, se optimizó y realizó un protocolo de transformación tisular (CLARITY), ligeramente modificado para su aplicación en el tejido cardíaco. De hecho, para obtener una reconstrucción eficiente en 3D de todo un corazón, es esencial prevenir el fenómeno de la dispersión de la luz. La metodología CLARITY nos permite obtener un corazón intacto altamente transparente, per…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto ha recibido fondos del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 952166 (REPAIR), MUR bajo el programa FISR, proyecto FISR2019_00320 y Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, proyecto PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Riferimenti
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