जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट शुरुआती भ्रूण के भीतर अंतर्जात संकेत केंद्रों से भ्रूण कोशिकाओं को अलग करके उत्पन्न होते हैं, अपेक्षाकृत भोले कोशिका समूहों को आसानी से हेरफेर और सुसंस्कृत पूर्व वीवोका उत्पादन करते हैं। यह लेख इस तरह के एक्सप्लांट बनाने के लिए निर्देश प्रदान करता है और गैस्ट्रेशन के दौरान नोडल सिग्नलिंग के लिए भूमिकाओं से पूछताछ करके उनकी उपयोगिता को दर्शाता है।
उनकी ऑप्टिकल स्पष्टता और तेजी से विकास के कारण, जेब्राफिश भ्रूण सेल व्यवहार और विकास प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली है। हालांकि, भ्रूणीय संकेतों की जटिलता और अतिरेक के कारण, प्रारंभिक भ्रूणजेने की बीमारी के दौरान किसी भी एक संकेत की पूरी भूमिका को समझना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म के पशु क्षेत्र को बाहर निकालकर, भ्रूणीय कोशिकाओं के अपेक्षाकृत भोले समूह उत्पन्न होते हैं जिन्हें आसानी से सुसंस्कृत और पूर्व वीवोमें हेरफेर किया जा सकता है। निष्कासन से पहले आरएनए इंजेक्शन द्वारा ब्याज की एक जीन शुरू करके, एक जीन अभिव्यक्ति, सेल व्यवहार, और सापेक्ष अलगाव में अन्य विकास प्रक्रियाओं पर इस अणु के प्रभाव का आकलन कर सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न जीनोटाइप या स्थितियों के भ्रूण से कोशिकाओं को कोशिका/ऊतक बातचीत और ऊतक-विशिष्ट जीन कार्यों की जांच करने के लिए एक ही चिमेरिक एक्सप्लांट में जोड़ा जा सकता है । यह लेख जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट पैदा करने के लिए निर्देश प्रदान करता है और यह दर्शाता है कि एक ही सिग्नलिंग अणु – एक नोडल लिगांड – अन्यथा भोले भ्रूणीय ऊतकों में रोगाणु परत गठन और विस्तार मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। एक सरलीकृत पूर्व वीवो प्रणाली में भ्रूण कोशिका व्यवहार, मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट, और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को फिर से काटना करने की उनकी क्षमता के कारण, इन एक्सप्लांट्स को कई जेब्राफिश शोधकर्ताओं के लिए महान उपयोगिता होने का अनुमान है।
विकासात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र का एक बारहमासी लक्ष्य पशु रूप और समारोह की उत्पत्ति को समझने के लिए भ्रूण के विकास की जटिलता को सुलझाना है। यहां तक कि शुरुआती भ्रूण में संकेत अणुओं, कोशिका और ऊतक बातचीत, और यांत्रिक बलों का एक जटिल मिश्रण होता है, जो सभी सख्त स्थानिक और लौकिक विनियमन के अधीन होते हैं। इस कारण से, यह अक्सर ब्याज की एक विकास प्रक्रिया में एक विशेष संकेत की सटीक भूमिका तुच्छ चुनौतीपूर्ण है । भ्रूण के ऊतकों को उनके अंतर्जात वातावरण से हटाकर, भ्रूण निष्कासन एक सरलीकृत मंच बनाता है जिसमें सापेक्ष अलगाव में व्यक्तिगत ऊतकों और अणुओं की विकासात्मक भूमिकाओं को समझने के लिए। एक्सोपेशन तकनीकों को शायद ज़ेनोपस लेविसमें जाना जाता है, जहां उनका उपयोग ऊतक प्रेरण, कोशिका संकेत, कोशिका आसंजन और मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए किया गया है, अन्य प्रक्रियाओं के बीच1,2,3,4। तथाकथित पशु टोपी एक्सप्लांट, जिसमें ब्लास्टुला चरण ज़ेनोपस भ्रूण के पशु क्षेत्र को प्रेरक बातचीत से पहले अलग किया जाता है5,6,7,एक व्यापक और शक्तिशाली एक्सप्लांट तकनीक हैं। बिना किसी जानवर की टोपियां 7 ,8ectodermबननेके लिएवसाितहैं । फिर भी, वे कई प्रेरक कारकों का जवाब देने में सक्षम हैं, जिससे वे तीनों रोगाणु परतों के ऊतकों का निर्माण कर सकते हैं और ऊतक-उपयुक्त मॉर्फोजेनेटिक आंदोलनों9,10,11से गुजरना करसकतेहैं। हालांकि, लाइव इमेजिंग के लिए सीमित आनुवंशिक उपकरण और उप-इष्टतम उपयुक्तता कई विकासात्मक जीवविज्ञानियों के लिए ज़ेनोपस पशु कैप एक्सप्लांट के उपयोग को रोकती है। जेब्राफिश भ्रूण से ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं को हटाकर, शोधकर्ता ऑप्टिकल स्पष्टता, आनुवंशिक उपकरणों की बहुतायत, और जेब्राफिश मॉडल प्रणाली के अन्य प्रयोगात्मक लाभों के साथ पशु टोपी परख की उपयोगिता को जोड़ सकते हैं।
आज तक, शोधकर्ताओं ने जेब्राफिश एक्सप्लांट के दो जायके का उपयोग किया है: तथाकथित पेस्कोइड और ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट। पेस्कोइड मॉडल में, सीमांत क्षेत्र सहित पूरे ब्लास्टोडर्म को जर्दी से अलग किया जाता है और एक्स वीवो को एक्स वीवो विकसित करने की अनुमति दी जाती है, बिना एक्स एम्ब्रेनिक जर्दी सिंकाइटियाल लेयर (वाईएसएल)12,13। इस तरह, पेस्कोइड जेन ओपेनहाइमर और जेपी ट्रिंकौस14, 15द्वारा दशकों पहले उत्पन्न फंडुलस एक्सप्लांट्स के लिए एक उल्लेखनीय समानता को सहन करते हैं। ये पौधे भ्रूणीय पैटर्निंग और मॉर्फोजेनेसिस12,13के कई पहलुओं को फिर से ढिंढाकरतेहैं . हालांकि, क्योंकि इन आइसोलेट में अंतर्जात संकेत केंद्र (भ्रूणीय मार्जिन) होते हैं, उन्हें उनके आणविक परिवेश के संबंध में सरल नहीं किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ता सीमांत क्षेत्र 16 , 17 ,18, 19, 20,21को छोड़कर अपेक्षाकृत भोले जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट उत्पन्न करसकतेहैं। अनमैनीप्ड जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) मॉर्फोजेन्स19 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं और पूर्व वीवो18को संस्कारित होने पर गैर-तंत्रिका ectoderm और घेर परत (ईवीएल) को जन्म देते हैं। हालांकि, वे एक्सोजेनस सिग्नलिंग ग्रेडिएंट्स19,20, 21केजवाब में एक्सियल पैटर्निंग और मॉर्फोजेनेसिस के कई पहलुओं को फिर से पहचानते हैं, जो ज़ेनोपस एनिमल कैप्स के समान हैं। इस कारण से, ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट एक सरलीकृत सिग्नलिंग वातावरण के भीतर रोगाणु परत विनिर्देश, मॉर्फोजेनेटिक सेल आंदोलनों और सिग्नलिंग ग्रेडिएंट्स में दिए गए मॉर्फोजेन (या मॉर्फोजन) की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल हैं। इसके अलावा, विभिन्न जीनोटाइप या स्थितियों के भ्रूण से ब्लास्टोडर्म को सेल/ऊतक स्वायत्तता और प्रेरक बातचीत की जांच करने के लिए एक ही चिमेरिक एक्सप्लांट19,21 में जोड़ा जा सकता है ।
जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट्स का उपयोग गैस्ट्रुलेशन के दौरान मॉर्फोजेनेसिस और ऊतक विनिर्देश में भ्रूणीय संकेतों (उदाहरण के लिए, नोडल) की भूमिका की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एकल कोशिका चरण में सिंथेटिक ndr2 आरएनए (एक नोडल लिगामेंट) इंजेक्शन द्वारा, नोडल सिग्नलिंग भ्रूण के ब्लास्टोडर्म भर में सक्रिय है। इन भ्रूणों से निकाले गए पौधे नोडल सिग्नलिंग ग्रेडिएंट उत्पन्न करते हैं, सभी तीन रोगाणु परतों का निर्माण करते हैं, और अक्षुण्ण भ्रूण20में देखे गए अभिसरण और विस्तार (सीएंडई) गैस्ट्रुलेशन आंदोलनों से गुजरते हैं। इसके अतिरिक्त, चिमेरिक एक्सप्लांट का उपयोग मेसोडर्म ऊतकों की क्षमता को स्पष्ट करने के लिए किया जाता है ताकि यूनिजेनेक्टेड (भोली) ब्लास्टोडर्म से न्यूरोेक्टोडर्म को प्रेरित किया जा सके। यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट बनाने के लिए निर्देश प्रदान करता है और ऊतक प्रेरण और मॉर्फोजेनेसिस में नोडल सिग्नलिंग की भूमिका को परिभाषित करने में उनकी उपयोगिता को दर्शाता है।
इस लेख में बताया गया है कि जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट कैसे उत्पन्न करें और गैस्ट्रुलेशन में नोडल मॉर्फोजेन सिग्नलिंग की भूमिका को संबोधित करने में इन एक्सप्लांट्स के दो व्यावहारिक अनुप्रयोगों पर चर्चा की। काटने और खेती explants की यह विधि भोली कोशिकाओं की एक खाली स्लेट प्रदान करता है कि आरएनए इंजेक्शन और छोटे अणु यौगिकों के साथ उपचार का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है ब्याज की एक आणविक मार्ग की जांच करने के लिए ।
महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में चार कदम हैं जो इसकी सफलता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । पहले नोडल की उचित राशि के साथ भ्रूण इंजेक्शन है । यह प्रोटोकॉल ndr2 आरएनए के 10 स्नातकोत्तर की सिफारिश करता है, और हालांकि खुराक की एक श्रृंखला विस्तार को बढ़ावा देती है, बहुत अधिक या बहुत कम नोडल इष्टतम एक्सप्लांट एक्सटेंशन20को रोक देगा। दूसरा कदम भ्रूण को डिकोरीटिंग करना है । यदि भ्रूण बहुत लंबे समय तक प्रोन्स में रहते हैं, तो जर्दी फट जाएगी, और भ्रूण काटने के लिए व्यवहार्य नहीं होगा। यदि वे काफी लंबे समय तक प्रोनेस में नहीं हैं, तो कोशन्स को धोने से ढीला नहीं किया जाएगा और इसके बजाय समय लेने वाले मैनुअल डिकेरेशन की आवश्यकता होगी। तीसरा महत्वपूर्ण कदम एक्सप्लांट्स को काट रहा है । 3x डैनिएउ के समाधान में काटने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि 0.3x डैनिएउ के समाधान या अंडे के पानी की कम नमक सामग्री उपचार और एक्सप्लांट के अस्तित्व को बढ़ावा नहीं देती है।
इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के भोलेपन को सुनिश्चित करने के लिए ब्लास्टोडर्म की लगभग आधी ऊंचाई पर एक्सप्लांट काटे जाने चाहिए। यदि वे जर्दी के बहुत करीब कट जाते हैं, तो उनमें मार्जिन (अंतर्जात नोडल सहित) के संकेत होंगे जो ऊतक विनिर्देश और मॉर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं। चौथा और अंतिम महत्वपूर्ण कदम चिमरिक एक्सप्लांट्स के उपचार में है। दो एक्सप्लांट कल्पना बनाने के लिए फ्यूज नहीं करेंगे जब तक कि उनके कट किनारों को काटने के तुरंत बाद धीरे-धीरे दबाया न जाए।
संशोधन और समस्या निवारण
ऊपर वर्णित महत्वपूर्ण कदम समस्या निवारण के अवसर प्रदान करते हैं। कुछ आम मुद्दे और प्रस्तावित समाधान नीचे प्रस्तुत किए जाते हैं ।
यदि नोडल सिग्नलिंग की उपस्थिति में एक्सप्लांट का विस्तार नहीं किया जा रहा है, तो कुछ संभावित समाधान हैं। (क) एकल कोशिका स्तर पर भ्रूण इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आरएनए पूरे भ्रूण में समान रूप से फैलाया जाए । (ख) इंजेक्शन बोलस को मापने के लिए माइक्रोमीटर का उपयोग करके इंजेक्शन की मात्रा सही है, यह सुनिश्चित करके बहुत अधिक नोडल आरएनए इंजेक्शन लगाने से बचें । (ग) यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह अपमानित न हो, इसकी एकाग्रता को मापकर बहुत कम नोडल आरएनए इंजेक्शन लगाने से बचें । (घ) कुछ उम्र से मेल खाने वाले अक्षुण्ण भाई बहनों को एक्सप्लांट के समकक्ष चरण का अनुमान लगाने के लिए रखें । जब अक्षुण्ण भाई बहन 2-5 सोमाइट चरण तक पहुंचते हैं तो एक्सप्लांट अधिकतम विस्तार प्राप्त करते हैं। यदि एक्सप्लांट बहुत जल्दी एकत्र किए जाते हैं, तो इष्टतम विस्तार तक नहीं पहुंचा जाएगा।
यदि जर्दी डिकेरियोशन के बाद फट रहे हैं, और भ्रूण को काटने के लिए व्यवहार्य नहीं हैं, एक बार chorions को कुरकुरा शुरू और 1-2 भ्रूण उनके chorion शेड के बाद उच्चारण समाधान से भ्रूण को हटा दें । इसके बाद अंडे के पानी में तुरंत कुल्ला करें।
यदि एक्सप्लांट किनारों के चारों ओर चुलबुली दिखाई देते हैं, तो कुछ समाधान हैं। (क) विकास की एक विशिष्ट समय सीमा के भीतर ही कट एक्सप्लांट्स । हालांकि 128 से 1000-सेल चरणों तक किसी भी स्तर पर कटौती के पौधे जीवित रह सकते हैं और संस्कृति में विस्तार कर सकते हैं, 256-से 512-सेल चरणों में कटौती करने वाले सबसे मजबूत होते हैं। (ख) यह सुनिश्चित करें कि उचित उपचार सुनिश्चित करने के लिए 3x दानीउ के समाधान में एक्सप्लांट्स में कटौती की जाती है । (ग) सफाई से लेकिन धीरे से एक्सप्लांट काटें । काटने की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को खींचने या खींचने से बचें।
यदि यूनिजेनेक्टेड नियंत्रण एक्सप्लांट का विस्तार हो रहा है, तो एक्सप्लांट जर्दी के बहुत करीब कटौती करने की संभावना थी। बैंगन भोले होने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि कटौती आधी जर्दी और ब्लास्टोडर्म के शीर्ष के बीच की जाती है।
यदि चिमरिक एक्सप्लांट फ्यूज करने में विफल रहते हैं, तो यह संभावना है क्योंकि 3x डैनिएउ के समाधान में एक्सप्लांट की प्रवृत्ति एक बार कटौती करने के लिए गोल और कट किनारे पर ठीक हो जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि दोनों ब्लास्टोडर्म खुद के बजाय एक-दूसरे को ठीक करते हैं, उन्हें काटने के तुरंत बाद एक साथ दबाएं। एगर के भीतर नए शामिल ब्लास्टोडर्म पर कोमल दबाव लागू करने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि उन्हें एक साथ ठीक करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सके।
सीमाओं
जबकि इन explants रिश्तेदार अलगाव में एक दिया मॉर्फोजेन (या ब्याज का एक और अणु) की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं, किसी भी पूर्व वीवो मॉडल में किए गए टिप्पणियों की देखभाल के साथ व्याख्या की जानी चाहिए । एक्सप्लांट सी एंड ई मॉर्फोजेनेसिस प्रदर्शित करते हैं जो वीवो20में देखे गए समान है, लेकिन वे गैस्ट्रुलेशन के सभी पहलुओं को पुन: रीकैपिटल नहीं करते हैं, उदाहरण के लिए, एपिली आंदोलन। वे भी कई अंय नियामक कारकों और संकेत अणुओं कि एक अक्षुण्ण भ्रूण के भीतर मौजूद है की कमी है । हालांकि यह एक्सप्लांट का एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक लाभ है, यह उन निष्कर्षों का भी कारण बन सकता है जो वीवो मेंनहीं हैं। उदाहरण के लिए, चूंकि एक्सोजेनस नोडल लिगामेंट्स प्राप्त नहीं करने वाले एक्सप्लांट न्यूरोेक्टोडर्म मार्कर व्यक्त करने में विफल रहते हैं, इसलिए कोई भी अकेले एक्सप्लांट से निष्कर्ष निकाल सकता है कि न्यूरोेक्टोडर्म विनिर्देश के लिए नोडल सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है। तथापि , न्यूरोएक्टोडर्म अक्षुण्ण भ्रूण के भीतर बनता है जिसमें सभी नोडल सिग्नलिंग23,24की कमी होती है , जो तंत्रिका विनिर्देश32में अन्य सिग्नलिंग अणुओं की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन करता है । Explants हमें बता सकते है कि एक मॉर्फोजेन एक अलग वातावरण में क्या करने में सक्षम है । फिर भी, ऐसे सभी निष्कर्षों की पुष्टि की जानी चाहिए/परिणामों के लिए अक्षुण्ण भ्रूण के साथ तुलना में अच्छी तरह से व्याख्या की जानी चाहिए । दूसरे शब्दों में, explants एक विकासशील भ्रूण की जगह नहीं ले जा सकते हैं । इसके बजाय, वे परिवेश के साथ एक मॉर्फोजेन की भूमिका और संबंधों की पहचान करने के लिए एक पूरक उपकरण हैं। इन सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, जेब्राफिश ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट कई शोध प्रश्नों के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं।
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
सिंथेटिक भ्रूणविज्ञान में नए सिरे से रुचि के साथ, कई पूर्व वीवो और इन विट्रो दृष्टिकोण नियमित रूप से भ्रूण विकास के मॉडल पहलुओं के लिए नियोजित कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, माउस या मानव भ्रूण/प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से बना 2 और 3 आयामी गैस्ट्रूलॉइड, बहिर्जात संकेत अणुओं के आवेदन के माध्यम से, कुछ पैटर्निंग और/या गैस्ट्रुलेशन, विभाजन, और न्यूरुलेशन33,34,35,36, 37 . हालांकि शक्तिशाली, इन तरीकों को श्रमसाध्य और लंबे समय तक संस्कृति के तरीकों की आवश्यकता होती है ताकि वे लगातार प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को बनाए रख सकें और गैस्ट्रॉयड विकसित करें, जिन्हें गैस्ट्रुलेशन चरणों तक पहुंचने में कई दिन लगते हैं। इसके विपरीत, ज़ेब्राफ़िश एक्सप्लांट्स को स्टेम सेल संस्कृतियों के रखरखाव की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि भ्रूण बस आवश्यकतानुसार एकत्र किए जाते हैं। वे उत्पन्न करने और घंटे के भीतर गैस्ट्रुलेशन चरणों तक पहुंचने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं, जो जेब्राफिश भ्रूण के समान हैं। यह जेब्राफिश एक्सप्लांट्स, उनकी अक्षुण्ण विकासात्मक घड़ी का एक और लाभ पर प्रकाश डालता है। क्योंकि भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के विकास की उंर चर और अत्यधिक बहस की जा सकती है, भ्रूण explants शायद बेहतर विकास के लौकिक विनियमन की जांच करने के लिए अनुकूल हैं । अंत में, जबकि पेस्कोइड ज़ेब्राफ़िश एक्सप्लांट (जिसमें भ्रूणीय मार्जिन होता है) इसी तरह संस्कृति12,13में विस्तारित होता है, वे एंडोजेनस सिग्नलिंग केंद्रों के जवाब में ऐसा करते हैं। इसके बजाय, यहां वर्णित explants शोधकर्ताओं को इस तरह के भ्रूण संकेतों से अपेक्षाकृत कम हस्तक्षेप के साथ ब्याज के अणुओं की जांच करने के लिए सक्षम ।
संभावित भविष्य के अनुप्रयोग
यहां, एक्सप्लांट का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि सीएंडई मॉर्फोजेनेसिस के लिए नोडल सिग्नलिंग आवश्यक और पर्याप्त है। फिर भी, यह अनुमान है कि वे कर सकते है और कई अंय विकास प्रक्रियाओं में कई अलग अलग अणुओं की भूमिका विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति के विनियमन, ढाल संकेत, और अतिरिक्त morphogenetic कार्यक्रमों । इसके अतिरिक्त, क्योंकि ये एक्सप्लांट कम से कम 24 एचपीएफ19तक व्यवहार्य हैं, यह उम्मीद की जा सकती है कि उनकी उपयोगिता विभाजन और ऑर्गेनोजेनेसिस जैसी प्रक्रियाओं में गैस्ट्रुलेशन से परे होगी, किसी भी प्रक्रिया जिसमें शोधकर्ता एक विकासात्मक खाली स्लेट की इच्छा रखते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनआईसीएचडी आर00एचडी091386 द्वारा एमएलकेडब्ल्यू और एनआईएचएस T32ES027801 से एएई को समर्थन दिया गया था।
1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
6-well plates | Fisher | FB012927 | |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
HEPES | VWR | JT4018-1 | |
Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
KCl | VWR | BDH9258-500G | |
Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
Mineral oil | VWR | MK635704 | |
NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
Tween-20 | VWR | 200002-836 |