טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.
Abstract
שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות כוללות בדרך כלל פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. יתר על כן, לשיטות גידול בתפוקה גבוהה המבוססות על מיקרו-פלטות שפותחו בשנים האחרונות יש מצב גידול מיקרוביאלי ירוד והקבלה ניסיונית בגלל החמצן המומס הנמוך שלהן, תערובת לקויה, אידוי חמור והשפעה תרמית. בשל יתרונות רבים של מיקרו-טיפות, כגון נפח קטן, תפוקה גבוהה ויכולת שליטה חזקה, הטכנולוגיה המיקרופלואידית מבוססת הטיפות יכולה להתגבר על בעיות אלה, אשר שימשה בסוגים רבים של מחקר של טיפוח מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה, סינון ואבולוציה. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים נשארים בשלב של בנייה ויישום מעבדה. כמה סוגיות מרכזיות, כגון דרישות תפעוליות גבוהות, קשיי בנייה גבוהים והיעדר טכנולוגיית אינטגרציה אוטומטית, מגבילים את היישום הרחב של טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות במחקר מיקרוביאלי. כאן, מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) פותחה בהצלחה על בסיס טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות, והשיגה שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור מקוון, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך גידול הטיפות המיקרוביאליות. בפרוטוקול זה, Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג פראי וזן E. coli חיוני למתנול (MeSV2.2) נלקחו כדוגמאות כדי להציג כיצד להשתמש ב- MMC כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ובעל תפוקה גבוהה יחסית ואבולוציה מסתגלת בפירוט. שיטה זו קלה לתפעול, צורכת פחות עבודה וריאגנטים, ויש לה תפוקה ניסיונית גבוהה ומקבילות נתונים טובות, שיש לה יתרונות גדולים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה עבור חוקרים מדעיים לביצוע מחקר מיקרוביאלי קשור.
Introduction
גידול מיקרוביאלי הוא בסיס חשוב למחקר מדעי מיקרוביולוגי וליישומים תעשייתיים, הנמצא בשימוש נרחב בבידוד, זיהוי, שחזור, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים 1,2,3. שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות משתמשות בעיקר במבחנות, צלוחיות שייק ולוחות מוצקים כמיכלי גידול, בשילוב עם אינקובטורים רועדים, ספקטרופוטומטרים, קוראי מיקרו-פלטות וציוד אחר לטיפוח, גילוי וסינון מיקרוביאליים. עם זאת, לשיטות אלה יש בעיות רבות, כגון פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. שיטות הטיפוח בתפוקה גבוהה שפותחו בשנים האחרונות מבוססות בעיקר על המיקרו-לוחית. אבל למיקרו-פלטה יש רמה נמוכה של חמצן מומס, תכונת ערבוב ירודה, והתאדות חמורה והשפעה תרמית, שלעתים קרובות מובילים למצב צמיחה ירוד ולהקבלה ניסיונית של מיקרואורגניזמים 4,5,6,7; מצד שני, הוא צריך להיות מצויד בציוד יקר, כגון תחנות עבודה לטיפול בנוזל וקוראי מיקרו-פלטות, כדי להשיג טיפוח אוטומטי וזיהוי תהליכים 8,9.
כענף חשוב של הטכנולוגיה המיקרופלואידית, מיקרופלואידיקה של טיפות פותחה בשנים האחרונות על בסיס מערכות מיקרופלואידיות מסורתיות של זרימה רציפה. זוהי טכנולוגיה מיקרופלואידית של זרימה בדידה המשתמשת בשני פאזות נוזליות בלתי חדירות (בדרך כלל מי שמן) כדי ליצור מיקרו-טיפות מפוזרות ולפעול עליהן10. מכיוון שלמיקרו-טיפות יש את המאפיינים של נפח קטן, שטח פנים ספציפי גדול, קצב העברת מסה פנימי גבוה, וללא זיהום צולב הנגרם על ידי מידור, והיתרונות של שליטה חזקה ותפוקה גבוהה של טיפות, היו סוגים רבים של מחקרים המיישמים טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות בטיפוח, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים בתפוקה גבוהה11 . עם זאת, יש עדיין סדרה של בעיות מפתח כדי להפוך את הטכנולוגיה microfluidic טיפות פופולרי ויישם באופן נרחב. ראשית, פעולת המיקרופלואידיקה של טיפות היא מסורבלת ומורכבת, וכתוצאה מכך דרישות טכניות גבוהות למפעילים. שנית, טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות משלבת רכיבים אופטיים, מכניים וחשמליים וצריכה להיות קשורה לתרחישי יישום ביוטכנולוגיה. קשה למעבדה או לצוות יחיד לבנות מערכות בקרה מיקרופלואידיות טיפות יעילות אם אין שיתוף פעולה רב-תחומי. שלישית, בגלל הנפח הקטן של מיקרו-טיפות (מפיקוליטר (pL) למיקרוליטר (μL)), נדרש קושי רב כדי להבין את הבקרה האוטומטית המדויקת ואת הזיהוי המקוון בזמן אמת של טיפות עבור כמה פעולות מיקרוביאליות בסיסיות כגון תת-גידול, מיון ודגימה, וקשה גם לבנות מערכת ציוד משולבת12.
על מנת להתמודד עם הבעיות הנ”ל, פותחה בהצלחה מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) המבוססת על טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות13. ה- MMC מורכב מארבעה מודולים פונקציונליים: מודול זיהוי טיפות, מודול זיהוי ספקטרום טיפות, מודול שבב מיקרופלואידי ומודול דגימה. באמצעות אינטגרציה ובקרה של המערכת של כל המודולים, מערכת הפעלה אוטומטית כולל ייצור, טיפוח, מדידה (צפיפות אופטית (OD) ופלואורסצנציה), פיצול, היתוך, מיון של טיפות נקבע במדויק, השגת שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך של טיפוח טיפות מיקרוביאליות. MMC יכול להכיל עד 200 יחידות גידול טיפות משוכפלות של נפח 2-3 μL, אשר שווה ערך ל -200 יחידות גידול של בקבוק שייק. מערכת גידול המיקרו-טיפות יכולה לספק את הדרישות של אי-זיהום, חמצן מומס, ערבוב והחלפת אנרגיה-מסה במהלך צמיחתם של מיקרואורגניזמים, ולענות על הצרכים השונים של מחקר מיקרוביאלי באמצעות פונקציות משולבות מרובות, למשל, מדידת עקומת גדילה, אבולוציה אדפטיבית, ניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד, ומחקר וניתוח מטבוליטים (המבוססים על זיהוי פלואורסצנציה)13,14.
כאן, הפרוטוקול מציג כיצד להשתמש ב-MMC כדי לבצע טיפוח אוטומטי ומיקרוביאלי ואבולוציה אדפטיבית בפירוט (איור 1). לקחנו את Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג בר כדוגמה כדי להדגים את מדידת עקומת הגדילה ואת זן E. coli החיוני למתנול MeSV2.215 כדי להדגים את האבולוציה ההסתגלותית ב-MMC. פותחה תוכנת הפעלה עבור MMC, מה שהופך את הפעולה לפשוטה וברורה מאוד. בכל התהליך, המשתמש צריך להכין את פתרון החיידקים הראשוני, להגדיר את התנאים של MMC, ולאחר מכן להזריק את תמיסת החיידקים ואת הריאגנטים הקשורים לתוך MMC. לאחר מכן, ה-MMC יבצע באופן אוטומטי פעולות כגון יצירת טיפות, זיהוי ומספור, טיפוח ואבולוציה אדפטיבית. הוא גם יבצע זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה) של הטיפות ברזולוציית זמן גבוהה ויציג את הנתונים הקשורים (אותם ניתן לייצא) בתוכנה. המפעיל יכול לעצור את תהליך הטיפוח בכל עת על פי התוצאות ולחלץ את טיפות המטרה לניסויים הבאים. ה- MMC קל לתפעול, צורך פחות עבודה וריאגנטים, ויש לו תפוקה ניסיונית גבוהה יחסית ומקבילות נתונים טובות, שיש להן יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול וחזקה לחוקרים לביצוע מחקרים מיקרוביאליים קשורים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח. MMC היא מערכת גידול מיקרוביאלית ממוזערת, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות ומכשירים קונבנציונליים לטיפוח בתפוקה גבוהה של מיקרוביאל בתפוקה גב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2018YFA0901500), הפרויקט הלאומי של מכשירים וציוד מדעיים מרכזיים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21627812), ותוכנית המחקר המדעי של יוזמת אוניברסיטת צינגהואה (20161080108). אנו מודים גם לפרופ’ ג’וליה א. וורהולט (המכון למיקרוביולוגיה, המחלקה לביולוגיה, ETH ציריך, ציריך 8093, שוויץ) על אספקת זן E. coli החיוני למתנול גרסה 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Riferimenti
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
