Automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon ved hjelp av mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC)
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker det mikrobielle mikrodropletkultursystemet (MMC) til å utføre automatisert mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon. MMC kan dyrke og underdyrke mikroorganismer automatisk og kontinuerlig og overvåke veksten på nettet med relativt høy gjennomstrømning og god parallellisering, noe som reduserer arbeids- og reagensforbruket.
Abstract
Konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder har vanligvis tungvinte operasjoner, lav gjennomstrømning, lav effektivitet og stort forbruk av arbeidskraft og reagenser. Videre har mikroplatebaserte dyrkingsmetoder med høy gjennomstrømning utviklet de siste årene dårlig mikrobiell vekststatus og eksperimenter parallellisering på grunn av lavt oppløst oksygen, dårlig blanding og alvorlig fordampning og termisk effekt. På grunn av mange fordeler med mikrodråper, for eksempel lite volum, høy gjennomstrømning og sterk kontrollerbarhet, kan den dråpebaserte mikrofluidiske teknologien overvinne disse problemene, som har blitt brukt i mange typer forskning på mikrobiell dyrking, screening og evolusjon med høy gjennomstrømning. Imidlertid forblir de fleste tidligere studier på scenen for laboratoriekonstruksjon og anvendelse. Noen sentrale problemstillinger, for eksempel høye operasjonelle krav, høy byggevansker og mangel på automatisert integrasjonsteknologi, begrenser den brede anvendelsen av mikrofluidisk dråpeteknologi i mikrobiell forskning. Her ble et automatisert Mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC) vellykket utviklet basert på mikrofluidisk dråpeteknologi, og oppnådde integrasjon av funksjoner som inokulasjon, dyrking, online overvåking, sub-dyrking, sortering og prøvetaking som kreves av prosessen med mikrobiell dråpekultivering. I denne protokollen ble wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 og en metanol-essensiell E. coli-stamme (MeSV2.2) tatt som eksempler for å introdusere hvordan du bruker MMC til å gjennomføre automatisert og relativt høy gjennomstrømning mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon i detalj. Denne metoden er enkel å betjene, bruker mindre arbeidskraft og reagenser, og har høy eksperimentell gjennomstrømning og god data parallellitet, som har store fordeler sammenlignet med konvensjonelle dyrkingsmetoder. Det gir en rimelig, driftsvennlig og resultatsikker eksperimentell plattform for vitenskapelige forskere å utføre relatert mikrobiell forskning.
Introduction
Mikrobiell dyrking er et viktig grunnlag for mikrobiologisk vitenskapelig forskning og industrielle anvendelser, som er mye brukt i isolasjon, identifisering, rekonstruksjon, screening og utvikling av mikroorganismer 1,2,3. Konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder bruker hovedsakelig reagensrør, risteflasker og faste plater som dyrkingsbeholdere, kombinert med ristende inkubatorer, spektrofotometere, mikroplatelesere og annet utstyr for mikrobiell dyrking, deteksjon og screening. Imidlertid har disse metodene mange problemer, for eksempel tungvinte operasjoner, lav gjennomstrømning, lav effektivitet og stort forbruk av arbeidskraft og reagenser. Dyrkingsmetodene for høy gjennomstrømning utviklet de siste årene er hovedsakelig basert på mikroplaten. Men mikroplaten har et lavt nivå av oppløst oksygen, dårlig blandingsegenskap og alvorlig fordampning og termisk effekt, noe som ofte fører til dårlig vekststatus og eksperimenter parallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; På den annen side må den være utstyrt med dyrt utstyr, for eksempel væskehåndteringsarbeidsstasjoner og mikroplatelesere, for å oppnå automatisert dyrking og prosessdeteksjon 8,9.
Som en viktig gren av mikrofluidisk teknologi har dråpemikrofluidikk blitt utviklet de siste årene basert på tradisjonelle mikrofluidiske systemer med kontinuerlig strømning. Det er en diskret strømningsmikrofluid teknologi som bruker to umiskjennelige væskefaser (vanligvis oljevann) for å generere dispergerte mikrodråper og operere på dem10. Fordi mikrodråper har egenskapene til lite volum, stort spesifikt overflateareal, høy intern masseoverføringshastighet og ingen krysskontaminering forårsaket av oppdeling, og fordelene ved sterk kontrollerbarhet og høy gjennomstrømning av dråper, har det vært mange typer forskning som bruker dråpemikrofluidisk teknologi i høygjennomstrømningsdyrking, screening og utvikling av mikroorganismer11 . Imidlertid er det fortsatt en rekke viktige problemer for å gjøre dråpemikrofluidisk teknologi popularisert og mye anvendt. For det første er driften av dråpemikrofluidikk tungvint og intrikat, noe som resulterer i høye tekniske krav til operatører. For det andre kombinerer mikrofluidisk dråpeteknologi optiske, mekaniske og elektriske komponenter og må assosieres med bioteknologiske applikasjonsscenarier. Det er vanskelig for et enkelt laboratorium eller team å bygge effektive mikrofluidiske dråpekontrollsystemer hvis det ikke er noe tverrfaglig samarbeid. For det tredje, på grunn av det lille volumet av mikrodråpe (fra picoliter (pL) til mikroliter (μL)), tar det mye vanskelig å realisere presis automatisert kontroll og sanntids online deteksjon av dråper for noen grunnleggende mikrobielle operasjoner som sub-dyrking, sortering og prøvetaking, og det er også vanskelig å konstruere et integrert utstyrssystem12.
For å løse problemene ovenfor ble et automatisk mikrobielt mikrodropletkultursystem (MMC) vellykket utviklet basert på dråpemikrofluidisk teknologi13. MMC består av fire funksjonelle moduler: en dråpegjenkjenningsmodul, en dråpespektrumdeteksjonsmodul, en mikrofluidisk brikkemodul og en prøvetakingsmodul. Gjennom systemintegrasjon og kontroll av alle modulene er automatisert operativsystem inkludert generering, dyrking, måling (optisk tetthet (OD) og fluorescens), splitting, fusjon, sortering av dråper nøyaktig etablert, og oppnår integrasjon av funksjoner som inokulasjon, dyrking, overvåking, sub-dyrking, sortering og prøvetaking som kreves av prosessen med mikrobiell dråpekultivering. MMC kan romme opptil 200 replikere dråpekultiveringsenheter med 2-3 μL volum, noe som tilsvarer 200 risteflaske dyrking enheter. Mikrodråpekultiveringssystemet kan tilfredsstille kravene til ikke-forurensning, oppløst oksygen, blanding og masseenergiutveksling under veksten av mikroorganismer, og møte de ulike behovene til mikrobiell forskning gjennom flere integrerte funksjoner, for eksempel vekstkurvemåling, adaptiv evolusjon, enkeltfaktoranalyse på flere nivåer og metabolittforskning og analyse (basert på fluorescensdeteksjon)13,14.
Her introduserer protokollen hvordan du bruker MMC til å utføre automatisert og mikrobiell dyrking og adaptiv evolusjon i detalj (figur 1). Vi tok wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 som et eksempel for å demonstrere vekstkurvemålingen og en metanol-essensiell E. coli-stamme MeSV2.215 for å demonstrere den adaptive utviklingen i MMC. En operasjonsprogramvare for MMC ble utviklet, noe som gjør operasjonen veldig enkel og tydelig. I hele prosessen må brukeren forberede den første bakterieløsningen, angi forholdene i MMC, og deretter injisere bakterieløsningen og relaterte reagenser i MMC. Deretter utfører MMC automatisk operasjoner som dråpegenerering, anerkjennelse og nummerering, dyrking og adaptiv evolusjon. Den vil også utføre online deteksjon (OD og fluorescens) av dråpene med høy tidsoppløsning og vise relaterte data (som kan eksporteres) i programvaren. Operatøren kan stoppe dyrkingsprosessen når som helst i henhold til resultatene og trekke ut måldråpene for etterfølgende eksperimenter. MMC er enkel å betjene, bruker mindre arbeidskraft og reagenser, og har relativt høy eksperimentell gjennomstrømning og god data parallellitet, som har betydelige fordeler sammenlignet med konvensjonelle dyrkingsmetoder. Det gir en rimelig, driftsvennlig og robust eksperimentell plattform for forskere å utføre relatert mikrobiell forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen presenterer hvordan du bruker det mikrobielle mikrodropletkultursystemet (MMC) til å utføre automatisert mikrobiell dyrking og langsiktig adaptiv evolusjon. MMC er et miniatyrisert, automatisert og mikrobielt dyrkingssystem med høy gjennomstrømning. Sammenlignet med konvensjonelle mikrobielle dyrkingsmetoder og instrumenter med høy gjennomstrømning, har MMC mange fordeler som lavt arbeids- og reagensforbruk, enkel drift, online deteksjon (OD og fluorescens), datainnsamling med høy tidsoppløsning…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project of the National Natural Science Foundation of China (21627812) og Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi takker også prof. Julia A. Vorholt (Institutt for mikrobiologi, Institutt for biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Sveits) for levering av metanol-essensielle E. coli-stammen versjon 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Riferimenti
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
