Bildereplikatoriske domener i ultrastrukturelt bevart kromatin av elektrontomografi
Summary
Denne protokollen presenterer en teknikk for høyoppløselig kartlegging av replikeringssteder i strukturelt bevart kromatin in situ som bruker en kombinasjon av pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold merking og ChromEMT.
Abstract
Prinsipper for DNA-folding i cellekjernen og dens dynamiske transformasjoner som oppstår under oppfyllelsen av grunnleggende genetiske funksjoner (transkripsjon, replikasjon, segregering, etc.) forblir dårlig forstått, delvis på grunn av mangel på eksperimentelle tilnærminger til høyoppløselig visualisering av spesifikk kromatin loci i strukturelt bevarte kjerner. Her presenterer vi en protokoll for visualisering av replikeringsdomener i monolayercellekultur in situ, ved å kombinere EdU-merking av nylig syntetisert DNA med påfølgende etikettdeteksjon med Ag-forsterkning av Nanogold-partikler og ChromEM-farging av kromatin. Denne protokollen muliggjør høykontrast, høyeffektiv forhåndsinnbyggingsmerking, kompatibel med tradisjonell glutaraldehydfiksering som gir den beste strukturelle bevaringen av kromatin for prøvebehandling ved romtemperatur. En annen fordel med forhåndsinnbygging av merking er muligheten til å forhåndsbestille celler av interesse for inndeling. Dette er spesielt viktig for analysen av heterogene cellepopulasjoner, samt kompatibilitet med elektrontomografi tilnærminger til høyoppløselig 3D-analyse av kromatinorganisasjon på replikeringssteder, og analyse av postreplikativ kromatin omorganisering og søsterkromotid segregering i interfasen.
Introduction
DNA-replikasjon er en grunnleggende biologisk prosess som kreves for trofast kopiering og overføring av genetisk informasjon under celledeling. Ved høyere eukaryoter blir DNA-replikasjon utsatt for stram romlig-temporal regulering, som manifesteres i sekvensiell aktivering av replikasjonsopprinnelse1. Nærliggende replikeringsopprinnelsesopprinnelse som avfyres synkront, danner klynger av svar2. På nivået av optisk mikroskopi oppdages steder med pågående DNA-replikasjon som replikasjonsfokus av forskjellig antall og størrelse. Replikasjonsfokus viser spesifikke mønstre for romlig fordeling i cellekjernen, avhengig av replikeringstidspunktet for det merkede DNA 3,4, som igjen er tett korrelert med genaktiviteten. Takket være veldefinert sekvens av DNA-replikasjon, strengt bestilt i rom og tid, er replikering en kraftig metode for presis DNA-merking, ikke bare for studiet av replikeringsprosess i seg selv, men også for å diskriminere en bestemt DNA-subfraksjon med definert transkripsjonsaktivitet og komprimeringsnivå. Visualisering av replikering av kromatin utføres vanligvis ved påvisning av store proteinkomponenter i DNA-replikasjonsmaskiner (enten ved immunstaining eller ved uttrykk for fluorescerende proteinkoder 5,6) eller ved inkorporering av modifiserte DNA-synteseforløpere 7,8,9,10 . Av disse er det bare metoder basert på inkorporering av modifiserte nukleotider i nylig replikert DNA som gjør det mulig å fange opp konformasjonsendringer i kromatin under replikering, og spore oppførselen til replikeringsdomener etter at replikeringen er fullført.
I høyere eukaryoter legger DNA-emballasje til kromatin et annet nivå av kompleksitet til regulering av grunnleggende genetiske funksjoner (transkripsjon, replikasjon, oppreisning, etc.). Kromatinfolding påvirker tilgjengeligheten av DNA til regulatoriske transfaktorer og DNA-konformasjonsendringer (dobbel helix-avslapping) som kreves for malsyntesen. Derfor er det generelt akseptert at DNA-avhengige syntetiske prosesser i cellekjernen krever en strukturell overgang av kromatin fra kondensert, undertrykkende tilstand til en mer tilgjengelig, åpen konformasjon. Cytologisk er disse to kromatinstatene definert som heterokromatin og eukromatin. Det er imidlertid fortsatt ingen konsensus om modusen for DNA-folding i kjernen. Hypotesene spenner fra en “polymersmelting” modell11, hvor nukleosomal fiber oppfører seg som en tilfeldig polymer som pakketettheten styres av faseseparasjonsmekanismer, til hierarkiske foldemodeller som postulerer sekvensiell dannelse av kromatinfiberlignende strukturer med økende tykkelse12,13. Hierarkiske foldemodeller fikk nylig støtte fra molekylære tilnærminger basert på analysen av in situ DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformasjonsfangst, 3C), som demonstrerer eksistensen av hierarkiet av kromatinstrukturelle domener14. Det er viktig å merke seg at replikeringsenheter korrelerer veldig godt med disse kromatindomenene15. Den største kritikken av disse modellene er basert på potensiell kunstig kromatinaggregering forårsaket av prøveprepareringsprosedyrer, for eksempel permeabilisering av cellemembraner og fjerning av ikke-kromatinkomponenter, for å forbedre kromatinkontrast for ultrastrukturelle studier samtidig som kromatintilgjengeligheten for ulike sonder (f.eks. antistoffer). Nylige tekniske fremskritt innen selektiv DNA-farging for elektronmikroskopi ved DNA-bindende fluoroformediert fotooksidasjon av diaminobenzidin (ChromEMT6) har tillatt eliminering av dette hinderet. De samme hensynene gjelder imidlertid for elektronmikroskopivisualisering av replikering av DNA17,18. Her beskriver vi en teknikk som muliggjør samtidig høyoppløselig ultrastrukturell kartlegging av nylig syntetisert DNA og total kromatin i intakte aldehyd-krysskoblede celler. Teknikken kombinerer deteksjon av EdU-merket DNA av Click-kjemi med biotinylerte sonder og streptavidin-Nanogold, og ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som er beskrevet her har flere fordeler i forhold til tidligere publiserte protokoller. For det første eliminerer bruken av Click-kjemi for merking av replikert DNA nødvendigheten av DNA-denatureringsforutsetning for BrdU-deteksjon med antistoffer, og dermed bedre bevare kromatin ultrastruktur.
For det andre minimerer utnyttelse av biotin som sekundær ligand som genereres etter glutaraldehydfiksering og riktig slukking av ubundne aldehydgrupper kjemisk modifikasjon av målet, og fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av RSF (tilskudd #17-15-01290) og RFBR (tilskudd #19-015-00273). Forfatterne takker Lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) og Nikon Center of Excellence i korrelativ bildebehandling ved Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology for tilgang til bildeinstrumentering.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Riferimenti
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
