La preparazione di campioni arricchiti di mitocondri da tessuti solidi archiviati precedentemente congelati ha permesso ai ricercatori di eseguire valutazioni sia funzionali che analitiche dei mitocondri in varie modalità sperimentali. Questo studio dimostra come preparare preparati arricchiti con mitocondri dal tessuto cardiaco congelato ed eseguire valutazioni analitiche dei mitocondri.
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Articolo metodologico
Misurazione dei complessi di trasferimento di elettroni mitocondriali nel tessuto cardiaco precedentemente congelato dalla prole della scrofa: un modello per valutare i cambiamenti bioenergetici mitocondriali indotti dall'esercizio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il profilo del complesso di trasferimento di elettroni mitocondriale (ETC) è modificato nel tessuto cardiaco della prole nata da una scrofa esercitata. L'ipotesi proposta e testata era che un regolare esercizio materno di una scrofa durante la gravidanza avrebbe aumentato l'efficienza mitocondriale della bioenergetica cardiaca della prole. Questa ipotesi è stata testata isolando i mitocondri utilizzando una procedura di isolamento lieve per valutare l'ETC mitocondriale e i profili supercomplessi. La procedura qui descritta ha permesso l'elaborazione di tessuti cardiaci archiviati precedentemente congelati ed ha eliminato la necessità di una preparazione di mitocondri freschi per la valutazione di complessi ETC mitocondriali, supercomplessi e profili di attività complessi ETC. Questo protocollo descrive la misurazione ottimale del complesso proteico ETC nell'immunoblotting a base di anticorpi multiplexati e nella valutazione super complessa utilizzando l'elettroforesi su gel blu-nativa.
Introduzione
L'obiettivo di questo protocollo era quello di fornire passaggi dettagliati per ottenere una preparazione arricchita con mitocondri da tessuto cardiaco precedentemente congelato con una nuova tecnologia di interruzione meccanica a bassa energia del tessuto che migliora la lisi tissutale e l'estrazione dei mitocondri. Con questo metodo, è possibile migliorare l'efficienza di estrazione senza generare elevate sollecitazioni di taglio o alte temperature e tempi di omogeneizzazione brevi (10-12 s)12 s1.
Ottenere mitocondri da tessuti congelati archiviati è una risorsa preziosa per eseguire studi sia fun....
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Protocollo
I tessuti cardiaci congelati della prole sono stati ricevuti dal Dr. Sean Newcomer insieme alla lettera di approvazione istituzionale IACUC. I tessuti cardiaci sono stati ottenuti da uno studio longitudinale a lungo termine, congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C per un uso futuro. Tutti i protocolli riguardanti l'elaborazione del tessuto cardiaco della prole hanno seguito le linee guida dei comitati IBC e IACUC della Kansas City University.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
NOTA: preparare tutti i campioni secondo le linee guida del produttore. Utilizzare acqua ultra-purificata o equivalente in tutte....
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Risultati
Seguendo il protocollo, è stata preparata una buona resa di miscela proteica arricchita con mitocondri dal tessuto cardiaco. Circa 15 mg/mL di miscela proteica arricchita con mitocondri sono stati ottenuti da una media di 1,2 g di tessuto cardiaco congelato raccolto dalla prole della scrofa. Le osservazioni hanno indicato che meno di 0,5 g di tessuto cardiaco congelato non producevano una quantità sufficiente di miscela proteica arricchita con mitocondriale per effettuare un test BN-PAGE. La quantità di preparazione mito.......
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Discussione
I passaggi critici per questo protocollo sono indicati qui. In primo luogo, l'omogeneizzazione dei tessuti deve essere gestita con cura in modo che non vengano applicati effetti eccessivi durante il processo di omogeneizzazione dei tessuti. Dovrebbe essere utilizzato un trituratore di tessuti, che fa parte della tecnologia del ciclo di pressione (PCT) per l'omogeneizzazione iniziale dei tessuti9. Questo passaggio ridurrà l'eccessivo ciclo di corsa dell'omogeneizzatore vetro su vetro (
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla sovvenzione intramurale della Kansas City University per Abdulbaki Agbas e dalla Summer Research Fellowship per Daniel Barrera. Gli autori sono grati per il lavoro editoriale del Dr. Jan Talley.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido amminocaproico | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Kit complesso Anti-Hu Total OxPhos | Invitrogen | 458199 | |
| anticorpo anti-VDAC | abcam | ab15895 | uso 1 &; g/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Omogeneizzatore per pestelli in vetro-vetro | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye coniugato anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Lettore di piastre multipozzetto | BioTek | Synergy HT | |
| Marcatore di peso molecolare nativo | ThermoFisher | BN2001 | |
| Monofilamento a rete di nylon | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Agitatore orbitale | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCCO Tampone di blocco | ThermoScienctific | 37527 | |
| Trituratore PULSE Tubo | Pressione Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Centrifuga da tavolo | Eppendorf | 5418 | |
| Tripsina | Amresco | M150-1G | |
| Inibitore della tripsina | Amresco | M191-1G | Richiede una nuova preparazione |
Riferimenti
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al.
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Ristampe e permessi
