In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Summary

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV’s) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV’s afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV’s, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

Abstract

Immunogene celdood van tumoren, veroorzaakt door chemotherapie of bestraling, kan tumorspecifieke T-celreacties veroorzaken door gevaargerelateerde moleculaire patronen vrij te geven en de productie van type I-interferon te induceren. Immunotherapieën, waaronder checkpoint-remming, vertrouwen voornamelijk op reeds bestaande tumorspecifieke T-cellen om een therapeutisch effect te ontvouwen. Synergetische therapeutische benaderingen die immunogene celdood gebruiken als een intrinsiek antikankervaccin kunnen dus hun reactievermogen verbeteren. Het spectrum van immunogene factoren die vrijkomen door cellen onder therapie-geïnduceerde stress blijft echter onvolledig gekarakteriseerd, vooral met betrekking tot extracellulaire blaasjes (EV’s). EV’s, vliezige deeltjes op nanoschaal die door vrijwel alle cellen worden uitgestoten, worden beschouwd als vergemakkelijken intercellulaire communicatie en bij kanker is aangetoond dat ze cross-priming tegen tumorantigenen bemiddelen. Om het immunogene effect van EV’s afgeleid van tumoren onder verschillende omstandigheden te beoordelen, wordt gezocht naar aanpasbare, schaalbare en geldige methoden. Daarom wordt hierin een relatief eenvoudige en robuuste aanpak gepresenteerd om de in vivo immunogeniciteit van EV’s te beoordelen. Het protocol is gebaseerd op flowcytometrie-analyse van milt T-cellen na in vivo immunisatie van muizen met EV’s, geïsoleerd door op neerslag gebaseerde assays van tumorcelculturen onder therapie of steady-state omstandigheden. Dit werk toont bijvoorbeeld aan dat oxaliplatineblootstelling van B16-OVA-muizenmelanoomcellen resulteerde in de afgifte van immunogene EV’s die de activering van tumorreactieve cytotoxische T-cellen kunnen bemiddelen. Daarom identificeert screening van EV’s via in vivo immunisatie en flowcytometrie omstandigheden waaronder immunogene EV’s kunnen ontstaan. Het identificeren van de voorwaarden voor immunogene EV-afgifte biedt een essentiële voorwaarde voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van EV’s tegen kanker en het verkennen van de onderliggende moleculaire mechanismen om uiteindelijk nieuwe inzichten te onthullen in de rol van EV’s in de immunologie van kanker.

Introduction

Het immuunsysteem speelt een cruciale rol in de strijd tegen kanker, zowel wanneer het wordt aangezet door immuuncheckpointremming als voor de werkzaamheid van conventionele kankertherapieën. Tumorcellen die bezwijken voor genotoxische therapieën zoals de chemotherapeutische middelen oxaliplatine en doxorubicine, of ioniserende bestralingsbehandeling kunnen antigenen en gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) vrijgeven die mogelijk een adaptieve anti-tumor immuunrespons ^initiëren1. De meest prominente DAMPs, in de context van immunogene celdood, omvatten find-me-signalen zoals chemotactische ATP, eat-me-signalen zoals de blootstelling van calreticuline, die de opname van tumorcellen door antigeen-presenterende cellen bevordert, en de afgifte van HMGB1, die patroonherkenningsreceptoren activeert, waardoor de kruispresentatie van tumorantigenen2 wordt verbeterd. Bovendien worden type I-interferonen (IFN-I), geïnduceerd via tumor-afgeleide immunogene nucleïnezuren of andere stimuli, waargenomen door dendritische cellen, waardoor ze tumorspecifieke cytotoxische T-cellen effectief kunnen ^primen3,4. Klinisch gezien bieden geactiveerde en prolifererende CD8 ⁺ T-cellen die de tumor infiltreren een onafhankelijke prognostische factor voor langdurige overleving bij veel kankerpatiënten. Vrijgegeven uit dergelijke geactiveerde T-cellen, bemiddelt IFN-γ directe antiproliferatieve effecten op kankercellen en drijft Th1-polarisatie en cytotoxische T-celdifferentiatie aan, waardoor wordt bijgedragen aan effectieve immunosurveillance tegen ^kanker5,6. Oxaliplatine is een bonafide immunogene celdoodinductor, die een dergelijke adaptieve immuunrespons tegen kanker ^bemiddelt7. De overvloed aan initiële immunogene signalen die door tumorcellen worden afgegeven onder door therapie veroorzaakte stress, moet echter nog volledig worden onthuld. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in kankerimmunotherapie, blijft het uitbreiden van de voordelen ervan naar een groter deel van de patiënten een uitdaging. Een meer gedetailleerd begrip van immunogene signalen die T-celactivatie initiëren, kan de ontwikkeling van nieuwe therapieën begeleiden.

Een heterogene groep van membraan-ingesloten structuren, bekend als extracellulaire blaasjes (EV’s), lijken te dienen als intercellulaire communicatie-apparaten. Uitgezonden door vrijwel alle celtypen, dragen EV’s functionele eiwitten, RNA, DNA en andere moleculen naar een ontvangende cel of kunnen de functionele toestand van een cel veranderen door zich te binden aan receptoren op het celoppervlak. Hun biologisch actieve lading varieert aanzienlijk door het type en de functionele toestand van de genererende ^cel8. In de kankerimmunologie worden EV’s die vrijkomen uit tumorcellen voornamelijk beschouwd als vijandig tegenover immunotherapie omdat ze uiteindelijk invasieve groei bevorderen, gemetastaseerde niches ^prevormen9 en de immuunrespons ^{onderdrukken10}. Daarentegen hebben sommige studies aangetoond dat EV’s tumorantigenen kunnen overbrengen naar dendritische cellen voor effectieve ^{kruispresentatie11,12}. EV’s kunnen immunostimulerende nucleïnezuren leveren als ze ontstaan onder door therapie geïnduceerde stress, waardoor een antitumorimmuunrespons ^{wordt vergemakkelijkt13,14}. Het is onlangs aangetoond dat detectie van dergelijke RNA- en DNA-aangeboren immuunliganden in de micro-omgeving van de tumor de responsiviteit op checkpointblokkade aanzienlijk moduleert15,16,17. Daarom moet de immunogene rol van EV’s die vrijkomen door tumorcellen onder verschillende therapie-geïnduceerde stress verder worden opgehelderd. Aangezien EV’s een jong maar groeiend onderzoeksgebied vormen, is de standaardisatie van methoden nog steeds aan de gang. Daarom is het delen van kennis essentieel om de reproduceerbaarheid van onderzoek naar interacties tussen EV’s en kankerimmunologie te verbeteren. Met dit in gedachten beschrijft dit manuscript een eenvoudig protocol om het immunogene effect van tumor-afgeleide EV’s in vivo te beoordelen.

Deze beoordeling wordt uitgevoerd door tumor-afgeleide EV’s te genereren, ontvangende muizen met die EV’s te immuniseren en milt-T-cellen te analyseren via flowcytometrie. EV-generatie wordt idealiter uitgevoerd door muriene tumorcellen te zaaien in een EV-vrij celkweekmedium voor een hoge mate van zuiverheid. Cellen worden behandeld met een specifieke celstressprikkel, zoals chemotherapie, om het effect van therapie-geïnduceerde EV’s te vergelijken met baseline immunogeniciteit van de respectieve tumor-afgeleide EV’s. De isolatie van EV’s kan heel goed worden uitgevoerd door verschillende technieken die moeten worden geselecteerd op basis van in vivo toepasbaarheid en lokale beschikbaarheid. Het volgende protocol beschrijft een op neerslag gebaseerde test met een commerciële kit voor EV-zuivering. Muizen worden twee keer geïmmuniseerd met die EV’s. Veertien dagen na de eerste injectie worden T-cellen uit de milt geëxtraheerd en geanalyseerd op IFN-γ productie via flowcytometrie om een systemische immuunrespons te evalueren. Hiermee wordt het potentieel van tumor-afgeleide EV’s, die onder verschillende therapeutische regimes ontstaan, om anti-tumor T-celresponsen te induceren relatief eenvoudig, snel en met hoge validiteit ^beoordeeld13. Daarom is deze methode geschikt voor een immunologische screening van EV’s afgeleid van kankercellen onder verschillende omstandigheden.

Protocol

Aan het begin van de experimenten waren muizen minstens 6 weken oud en werden ze onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Dit protocol voldoet aan de institutionele ethische normen en de geldende lokale regelgeving. Dierstudies werden goedgekeurd door de lokale regelgevende instantie (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland). Mogelijke geslachtsgerelateerde vooroordelen werden in deze studies niet onderzocht. 1. Generatie en isolatie van EV’s afgeleid van tumorcellen na blo…

Representative Results

Dit protocol is bedoeld om de eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbare beoordeling van de immunogeniciteit van tumor-afgeleide EV’s te vergemakkelijken. Hierbij worden muizen geënt met EV’s afgeleid van in vitro culturen van tumorcellen die het modelantigeen kippenovoalbumine (OVA) tot expressie brengen. De daaropvolgende immuunrespons wordt geanalyseerd in milt T-cellen via flowcytometrie. Figuur 1 geeft een overzicht van de praktische stappen…

Discussion

Dit protocol biedt een immunologische in vivo beoordeling van EV’s afgeleid van melanoomcellen onder chemotherapie-geïnduceerde stress, terwijl het zich aanpast aan EV’s die worden uitgezonden door verschillende kankers onder verschillende behandelingen. Het immuniseren van muizen met EV’s afgeleid van met oxaliplatine behandelde B16-OVA-cellen, bijvoorbeeld, breidt IFN-γ-producerende CD8 ⁺ T-cellen in de milt uit, die verder worden gestimuleerd door ex vivo incubatie met ovalbumine, wat wi…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)