Fluorescerande mätning i realtid av synaptiska funktioner i modeller av amyotrofisk lateralskleros

Summary

Två relaterade metoder beskrivs för att visualisera subcellulära händelser som krävs för synaptisk överföring. Dessa protokoll möjliggör realtidsövervakning av dynamiken i presynaptisk kalciuminflöde och synaptisk vesiklarmembranfusion med hjälp av levande cellavbildning av in vitro-odlade neuroner.

Abstract

Före neuronal degeneration är orsaken till motoriska och kognitiva underskott hos patienter med amyotrofisk lateralskleros (ALS) och / eller frontotemporal lobdemens (FTLD) dysfunktion i kommunikationen mellan neuroner och motorneuroner och muskler. Den underliggande processen för synaptisk överföring involverar membrandepolariseringsberoende synaptisk vesiklarfusion och frisättning av neurotransmittorer i synapsen. Denna process sker genom lokaliserad kalciuminflöde i de presynaptiska terminalerna där synaptiska vesiklar finns. Här beskriver protokollet fluorescensbaserade live-imaging-metoder som på ett tillförlitligt sätt rapporterar depolariseringsmedierad synaptisk vesikleexocytos och presynaptisk terminal kalciuminflödesdynamik i odlade neuroner.

Med hjälp av ett styrylfärgämne som ingår i synaptiska vesiklarmembran belyses den synaptiska vesiklarsättningen. Å andra sidan, för att studera kalciuminträde, används Gcamp6m, en genetiskt kodad fluorescerande reporter. Vi använder hög kaliumkloridmedierad depolarisering för att efterlikna neuronal aktivitet. För att kvantifiera synaptisk vesiklexocytos entydigt mäter vi förlusten av normaliserad styrylfärgfluorescens som en funktion av tiden. Under liknande stimuleringsbetingelser, vid kalciuminflöde, ökar Gcamp6m-fluorescensen. Normalisering och kvantifiering av denna fluorescensförändring utförs på ett liknande sätt som styrylfärgprotokollet. Dessa metoder kan multiplexeras med transfektionsbaserat överuttryck av fluorescerande märkta mutanta proteiner. Dessa protokoll har använts i stor utsträckning för att studera synaptisk dysfunktion i modeller av FUS-ALS och C9ORF72-ALS, med användning av primära gnagare kortikala och motoriska neuroner. Dessa protokoll möjliggör enkelt snabb screening av föreningar som kan förbättra neuronal kommunikation. Som sådan är dessa metoder värdefulla inte bara för studier av ALS utan för alla områden av neurodegenerativ och utvecklingsneurovetenskaplig forskning.

Introduction

Modellering av amyotrofisk lateralskleros (ALS) i laboratoriet görs unikt utmanande på grund av den överväldigande sporadiska karaktären hos över 80 % av ^fallen1, i kombination med det stora antalet genetiska mutationer som är kända för att vara sjukdomsorsakande2. Trots detta delar alla fall av ALS den förenande egenskapen att före direkt neuronal degeneration finns det dysfunktionell kommunikation mellan presynaptiska motorneuroner och postsynaptiska ^{muskelceller3,4}. Kliniskt, när patienter förlorar anslutningen av de återstående övre och nedre motorneuronerna, presenterar de funktioner av neuronal hyper- och hypoexcitabilitet under hela sjukdomen5,6,7,8,9, vilket återspeglar komplexa underliggande molekylära förändringar i dessa synapser, som vi som ALS-forskare försöker förstå.

Flera transgena modeller har illustrerat att försämring och desorganisation av den neuromuskulära korsningen sker med uttrycket av ALS-orsakande genetiska mutationer, inklusive ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 och TDP4317,18,19 genom morfologiska bedömningar, inklusive utvärdering av synaptiska boutons, ryggradstätheter och pre/postsynaptisk organisation. Mekaniskt, sedan Coles, Hodgkins och Huxleys landmärkespapper på 1930-talet, har det också varit möjligt att utvärdera synaptiska svar genom elektrofysiologiska tekniker i antingen in vitro-cellodling eller vävnadsskivberedningar20. Genom dessa strategier har många modeller av ALS visat synaptiska överföringsunderskott. Till exempel orsakar en mutant variant av TDP43 förbättrad avfyrningsfrekvens och minskar tröskeln för åtgärdspotential i NSC-34 (ryggmärg x neuroblastom hybridcellinje 34) motorneuronliknande ^celler21. Samma variant orsakar också dysfunktionell synaptisk överföring vid den neuromuskulära korsningen (NMJ) före uppkomsten av beteendemässiga motoriska underskott i en ^musmodell22. Det har tidigare visats att muterat FUS-uttryck resulterar i minskad synaptisk överföring vid NMJ i en drosophilamodell av FUS-ALS före rörelsedefekter11. En nyligen genomförd rapport med användning av inducerade pluripotenta stamceller härledda från C9orf72-expansionsbärare avslöjade en minskning av den lätt frisläppbara poolen av synaptiska ^vesiklar23. Sammantaget belyser dessa studier och andra vikten av att bygga en mer omfattande förståelse för mekanismerna bakom synaptisk signalering i sjukdomsrelevanta modeller av ALS. Detta kommer att vara avgörande för att förstå patobiologin för ALS och utveckla potentiella terapeutiska mål för patienter.

Metoder för ström- och spänningsklämningsceller har varit ovärderliga för att bestämma membranegenskaper såsom konduktans, vilande membranpotential och kvantinnehåll i enskilda ^{synapser20,24}. En av de betydande begränsningarna med elektrofysiologi är dock att den är tekniskt utmanande och bara ger insikter från en enda neuron åt gången. Konfokalmikroskopi med levande celler, i kombination med specifika fluorescerande sonder, ger möjlighet att undersöka den synaptiska överföringen av neuroner på ett spatiotemporalt sätt25,26,27. Även om det inte är ett direkt mått på neuronal excitabilitet, kan denna fluorescensmetod ge en relativ mätning av två molekylära korrelationer av synaptisk funktion: synaptisk vesiklarsättning och kalciumtransienter vid synaptiska terminaler.

När en åtgärdspotential når den presynaptiska terminala regionen av neuroner utlöses kalciumtransienter, vilket underlättar övergången från en elektrisk signal till processen för frisättning av ^{neurotransmittorer28}. Spänningsgrindade kalciumkanaler lokaliserade till dessa områden reglerar kalciumsignaleringen tätt för att modulera kinetiken för frisättning av ^{neurotransmittorer29}. De första rapporterade fluorescensbaserade inspelningarna av kalciumtransienter utfördes med användning av antingen dubbelvåglängdsindikatorn Fura-2 AM eller det enda våglängdsfärgämnet Fluo-3 AM30,31,32. Även om dessa färgämnen erbjöd stor ny insikt vid den tiden, lider de av flera begränsningar, såsom icke-specifik uppdelning i celler, aktiv eller passiv färgförlust från märkta celler, fotoblekning och toxicitet om de avbildas under längre ^{tidsperioder33}. Under det senaste decenniet har genetiskt kodade kalciumindikatorer blivit arbetshästar för avbildning av olika former av neuronal aktivitet. Dessa indikatorer kombinerar ett modifierat fluorescerande protein med ett kalciumkelatorprotein som snabbt växlar fluorescensintensitet efter bindningen av ^{Ca2+ joner34}. Tillämpningen av dessa nya indikatorer är omfattande, vilket möjliggör mycket enklare visualisering av intracellulära kalciumtransienter både in vitro– och in vivo-inställningar. En familj av dessa genetiskt kodade reportrar, känd som GCaMP, används nu i stor utsträckning. Dessa indikatorer innehåller en C-terminal kalmodulindomän, följt av grönt fluorescerande protein (GFP), och är begränsade av en N-terminal kalmodulinbindande ^region35,36. Kalciumbindning till kalmodulindomänen utlöser en interaktion med den kalmodulinbindande regionen, vilket resulterar i en konformationsförändring i den totala proteinstrukturen och en väsentlig ökning av fluorescensen hos GFP-delen35,36. Under årens lopp har denna familj av reportrar genomgått flera utvecklingar för att möjliggöra distinkta avläsningar för specifika kalciumtransienter med specifik kinetik (långsam, medium och snabb), var och en med något olika ^{egenskaper37,38}. Här har användningen av reportern GcaMP6 belysts, som tidigare har visat sig detektera enstaka åtgärdspotentialer och dendritiska kalciumtransienter i neuroner både in vivo och in vitro37.

Kalciumtransienter i den presynaptiska regionen utlöser synaptiska vesiklarfusionshändelser, vilket orsakar frisättning av neurotransmittorer i synapsen och initiering av signalhändelser i den postsynaptiska ^cellen28,39. Synaptiska vesiklar frigörs både snabbt och återvinns, eftersom cellen homeostatiskt upprätthåller en stabil cellmembranyta och lätt frigörbar pool av fusionskapabla membranbundna ^vesiklar40. Styrylfärgämnet som används här har en affinitet mot lipidmembran och ändrar specifikt dess emissionsegenskaper baserat på ordningen av den omgivande ^{lipidmiljön41,42}. Således är det ett idealiskt verktyg för märkning av återvinning av synaptiska vesiklar och efterföljande spårning av dessa vesiklar när de senare frigörs efter neuronal ^{stimulering41,42}. Protokollet som har genererats och optimerats är en anpassning av de begrepp som ursprungligen beskrevs av Gaffield och kollegor, vilket gör att vi kontinuerligt kan visualisera styrylfärgmärkt synaptisk vesiklarecta över ^tiden41.

Här beskrivs två relaterade fluorescensbaserade metoder som på ett tillförlitligt sätt rapporterar specifika cellulära händelser som är involverade i synaptisk överföring. Protokoll har definierats för att undersöka dynamiken i depolariseringsmedierad presynaptisk terminal kalciuminflöde och synaptisk vesikleexocytos i odlade neuroner. Här fokuseras metoder och representativa resultat på att använda primära gnagare kortikala eller motoriska neuroner som in vitro-modellsystem, eftersom det finns publicerade studier med dessa ^{celltyper43,44}. Dessa metoder är emellertid också tillämpliga på differentierade humana ⁱ³ kortikala ^nervceller45, eftersom vi också har haft framgång med båda protokollen i för närvarande pågående experiment i vårt laboratorium. Det allmänna protokollet beskrivs i ett stegvis linjärt format, som visas i figur 1. I korthet, för att studera kalciumdynamiken i neuriter transfekteras mogna neuroner med plasmid-DNA för att uttrycka den fluorescerande reportern GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) ^{promotor37,46}. Transfekterade celler har en låg nivå av basal grön fluorescens, vilket ökar i närvaro av kalcium. Regioner av intresse specificeras för att övervaka fluorescensförändringar under hela vår manipulation. Detta gör det möjligt att mäta mycket rumsligt och tidsmässigt lokaliserade fluktuationer i ^kalcium37,46. För utvärdering av synaptisk vesiklarfusion och frisättning laddas mogna neuroner med styrylfärgämne införlivat i synaptiska vesiklarmembran när de återvinns, reformeras och laddas om med neurotransmittorer i presynaptiska celler41,42,43,47,48. De nuvarande färgämnena som används för detta ändamål märker synaptiska vesiklar längs neuriter och används som proxy för dessa regioner i live-imaging-experiment, vilket visades genom samfärgning av styrylfärgämne och synaptotagmin av Kraszewski och ^kollegor49. Här ingår representativa bilder av liknande färgning som också har utförts (figur 2A). Tidigare utredare har i stor utsträckning använt sådana färgämnen för att rapportera synaptisk vesikeldynamik vid den neuromuskulära korsningen och hippocampala neuroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Genom att välja punkterade regioner av färgladdade vesiklar och genom att övervaka minskningar av fluorescensintensiteten efter vesiklarsättning kan funktionell synaptisk överföringskapacitet och temporal frisättningsdynamik studeras efter ^{stimulering43}. För båda metoderna används ett medium innehållande en hög koncentration av kaliumklorid för att depolarisera celler för att efterlikna neuronal aktivitet. Bildparametrar anges för att fånga intervall under sekunden som spänner över en baslinjenormalisering följt av vår stimuleringsfångstperiod. Fluorescensmätningar vid varje tidpunkt bestäms, normaliseras till bakgrunden och kvantifieras under den experimentella tidsperioden. Kalciuminflödesmedierad GCaMP6m fluorescensökning eller effektiv synaptisk vesiklarexocytocytos styrylfärgämne frisättning fluorescens minskning kan detekteras genom denna strategi. Detaljerad metodologisk inställning och parametrar för dessa två protokoll och en diskussion om deras fördelar och begränsningar beskrivs nedan.

Bild 1: Visuell återgivning av den övergripande allmänna protokollprocessen. (1) Isolera och odla primära gnagareneuroner in vitro till vald mognadstidspunkt. (2) Introducera GCaMP-DNA eller styrylfärgämne som rapportörer av synaptisk aktivitet. (3) Inställningsavbildningsparadigm med hjälp av live-imaging-utrustat konfokalmikroskop och tillhörande programvara. Påbörja baslinjeinspelningsperioden. (4) Medan celler fortfarande genomgår live-image-fångst, stimulera neuroner via hög KCl-badperfusion. (5) Bedöma fluorescensintensitetsmätningar över tid för att mäta kalciumtransienter eller synaptisk vesiklarfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla djurförsök som utfördes i denna studie godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Jefferson University. 1. Primär kultur av neuroner från embryonal råttcortex OBS: Primära kortikala nervceller isoleras från E17.5 råttembryon som tidigare beskrivits57,58. Ingen stambias verkar existera med framgången med detta odlingsprotokoll. Denna metod beskrivs kortfattat nedan. De tidigare…

Representative Results

Efter den framgångsrika implementeringen av ovanstående protokoll visas representativa resultat för ett typiskt styrylfärgämne synaptiskt vesiklarfrisättningsexperiment. Odlade råtta primära kortikala nervceller laddades med färgämne med hjälp av den metod som beskrivs i avsnitt 6. Specificiteten av färgämnesbelastning bestämdes genom sammärkning med synaptisk vesiklarmarkörsynaptofysin. En majoritet av styrylfärgämnets positiva puncta är medpositiva för denna markör (figur 2A</s…

Discussion

Tre steg som är gemensamma för båda metoderna som beskrivs är av avgörande betydelse för experimentell framgång och kvantifierbara resultat. För det första är det viktigt att förbereda färsk aCSF före varje experimentomgång enligt bifogade instruktioner. Underlåtenhet att göra detta kan förhindra lämplig neuronal depolarisering. Ett prov av obehandlade kontrollneuroner bör ständigt testas före stimulering av några experimentella grupper för att säkerställa korrekt cellulär depolarisering och ge …

Materials

20x air objective	Nikon		For imaging
40x oil immersion objective	Nikon		For imaging
B27 supplement	Thermo Scientific	17504044	Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood	Baker	SterilGARD III SG403A	Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148	For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418	For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	223506	Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator	Thermo Scientific	13-998-123	For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For neuronal culture preparation
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti +A1R core	For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera	Photometrics		For image acquisition
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270	Component of aCSF solutions
DNase	Millipore Sigma	D5025	For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats	Charles river	400SASSD	For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube	Nikon	77032509	For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye	Invitrogen	T13320	For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette	Grainger	52NK56	For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Millipore Sigma	H6648	For preparing neuronal cultures
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
horse serum	Millipore Sigma	H1138	For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood	NUAIRE	NU-301-630	For preparing neuronal cultures
Laminin	Thermo Scientific	23017015	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Scientific	11668019	For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride	Millipore Sigma	208337	Component of aCSF solutions
Microsoft Excel	Microsoft		Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium	Thermo Scientific	21103049	For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes	Thermo Scientific	339650	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	For preparing neuronal cultures
Papain	Millipore Sigma	P4762	For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system	Warner Instruments	SF-77B	For exchange of aCSF
Perfusion tubing	Cole-Parmer	UX-30526-14	Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid	Addgene	40754	For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide	Millipore Sigma	P7886	Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761	Component of aCSF solutions
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888	Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator	Tokai Hit		For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube	Nikon	77032809	For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor	Millipore Sigma	T6414	For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table	New Port	VIP320X2430-135520	Table/stand for microscope