Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

Summary

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Abstract

Avant la dégénérescence neuronale, la cause des déficits moteurs et cognitifs chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et / ou de démence du lobe frontotemporal (FTLD) est un dysfonctionnement de la communication entre les neurones et les motoneurones et les muscles. Le processus sous-jacent de transmission synaptique implique la fusion des vésicules synaptiques dépendantes de la dépolarisation membranaire et la libération de neurotransmetteurs dans la synapse. Ce processus se produit par l’afflux localisé de calcium dans les terminaux présynaptiques où résident les vésicules synaptiques. Ici, le protocole décrit des méthodologies d’imagerie en direct basées sur la fluorescence qui rapportent de manière fiable l’exocytose des vésicules synaptiques médiées par la dépolarisation et la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique dans les neurones cultivés.

À l’aide d’un colorant stylique incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques, la libération des vésicules synaptiques est élucidée. D’autre part, pour étudier l’entrée du calcium, Gcamp6m est utilisé, un rapporteur fluorescent génétiquement codé. Nous utilisons une dépolarisation à haute teneur en chlorure de potassium pour imiter l’activité neuronale. Pour quantifier sans ambiguïté l’exocytose des vésicules synaptiques, nous mesurons la perte de fluorescence normalisée du colorant styryl en fonction du temps. Dans des conditions de stimulation similaires, en cas d’afflux de calcium, la fluorescence de Gcamp6m augmente. La normalisation et la quantification de ce changement de fluorescence sont effectuées de la même manière que le protocole du colorant styryl. Ces méthodes peuvent être multiplexées avec une surexpression basée sur la transfection de protéines mutantes marquées par fluorescence. Ces protocoles ont été largement utilisés pour étudier le dysfonctionnement synaptique dans des modèles de FUS-ALS et de C9ORF72-ALS, en utilisant des corticaux et des motoneurones de rongeurs primaires. Ces protocoles permettent facilement un dépistage rapide des composés susceptibles d’améliorer la communication neuronale. En tant que telles, ces méthodes sont précieuses non seulement pour l’étude de la SLA, mais aussi pour tous les domaines de la recherche en neurosciences neurodégénératives et développementales.

Introduction

La modélisation de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) en laboratoire est rendue particulièrement difficile en raison de la nature extrêmement sporadique de plus de 80 % des ^cas1, associée au grand nombre de mutations génétiques connues pour être à l’origine de la ^maladie2. Malgré cela, tous les cas de SLA partagent la caractéristique unificatrice qu’avant la dégénérescence neuronale pure et simple, il existe une communication dysfonctionnelle entre les motoneurones présynaptiques et les cellules musculaires postsynaptiques3,4. Cliniquement, à mesure que les patients perdent la connectivité des motoneurones supérieurs et inférieurs restants, ils présentent des caractéristiques d’hyper- et d’hypoexcitabilité neuronale tout au long de la ^{maladie5,6,7,8,9}, reflétant des changements moléculaires sous-jacents complexes à ces synapses, que nous, en tant que chercheurs sur la SLA, cherchons à comprendre.

Plusieurs modèles transgéniques ont montré que la détérioration et la désorganisation de la jonction neuromusculaire se produisent avec l’expression de mutations génétiques responsables de la SLA, y compris ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 et TDP4317,18,19 par des évaluations morphologiques, y compris l’évaluation des boutons synaptiques, des densités de la colonne vertébrale et de l’organisation pré/postsynaptique. Mécaniquement, depuis les articles historiques de Cole, Hodgkin et Huxley dans les années 1930, il a également été possible d’évaluer les réponses synaptiques grâce à des techniques électrophysiologiques dans des cultures cellulaires in vitro ou des préparations de tranches de ^tissu20. Grâce à ces stratégies, de nombreux modèles de SLA ont démontré des déficits de transmission synaptique. Par exemple, une variante mutante de TDP43 améliore la fréquence de tir et diminue le seuil de potentiel d’action dans les cellules de type moteur-neurone NSC-34 (moelle épinière x neuroblastome hybride lignée 34)²¹. Cette même variante provoque également une transmission synaptique dysfonctionnelle à la jonction neuromusculaire (NMJ) avant l’apparition de déficits moteurs comportementaux chez un modèle ^murin22. Il a déjà été démontré que l’expression mutante de FUS entraîne une réduction de la transmission synaptique au NMJ dans un modèle de drosophile de FUS-ALS avant les défauts locomoteurs11. Un rapport récent utilisant des cellules souches pluripotentes induites dérivées de porteurs d’expansion C9orf72 a révélé une réduction du pool facilement libérable de vésicules ^{synaptiques23}. Dans l’ensemble, ces études et d’autres soulignent l’importance d’acquérir une compréhension plus complète des mécanismes sous-jacents à la signalisation synaptique dans les modèles de SLA pertinents pour la maladie. Cela sera essentiel pour comprendre la pathobiologie de la SLA et développer des cibles thérapeutiques potentielles pour les patients.

Les méthodes de serrage du courant et de la tension ont été inestimables pour déterminer les propriétés de la membrane telles que la conductance, le potentiel de la membrane au repos et le contenu quantifial des synapses ^{individuelles20,24}. Cependant, l’une des limites importantes de l’électrophysiologie est qu’elle est techniquement difficile et ne fournit des informations qu’à partir d’un seul neurone à la fois. La microscopie confocale à cellules vivantes, associée à des sondes fluorescentes spécifiques, offre la possibilité d’étudier la transmission synaptique des neurones de manière spatio-temporelle25,26,27. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une mesure directe de l’excitabilité neuronale, cette approche de fluorescence peut fournir une mesure relative de deux corrélations moléculaires de la fonction synaptique: la libération de vésicules synaptiques et les transitoires calciques aux terminaux synaptiques.

Lorsqu’un potentiel d’action atteint la région terminale présynaptique des neurones, des transitoires calciques sont déclenchés, facilitant la transition d’un signal électrique au processus de libération de ^{neurotransmetteurs28}. Les canaux calciques voltage-dépendants localisés dans ces zones régulent étroitement la signalisation du calcium pour moduler la cinétique de libération de neurotransmetteurs29. Les premiers enregistrements basés sur la fluorescence des transitoires de calcium ont été effectués à l’aide de l’indicateur à double longueur d’onde Fura-2 AM ou du colorant à longueur d’onde unique Fluo-3 AM30,31,32. Bien que ces colorants aient offert de nouvelles perspectives à l’époque, ils souffrent de plusieurs limitations telles que le compartimentage non spécifique au sein des cellules, la perte de colorant actif ou passif des cellules marquées, le photoblanchiment et la toxicité s’ils sont imagés sur de longues périodes de ^temps33. Au cours de la dernière décennie, les indicateurs de calcium génétiquement codés sont devenus les chevaux de bataille pour l’imagerie de diverses formes d’activité neuronale. Ces indicateurs combinent une protéine fluorescente modifiée avec une protéine chélateur de calcium qui change rapidement d’intensité de fluorescence après la liaison des ions ^Ca2+34. L’application de ces nouveaux indicateurs est vaste, permettant une visualisation beaucoup plus facile des transitoires de calcium intracellulaires à la fois in vitro et in vivo. Une famille de ces rapporteurs génétiquement codés, connue sous le nom de GCaMP, est maintenant largement utilisée. Ces indicateurs contiennent un domaine de calmoduline C-terminal, suivi d’une protéine fluorescente verte (GFP), et sont coiffés d’une région de liaison à la calmoduline ^{N-terminale35,36}. La liaison du calcium au domaine de la calmoduline déclenche une interaction avec la région de liaison à la calmoduline, entraînant un changement conformationnel de la structure protéique globale et une augmentation substantielle de la fluorescence de la fraction ^GFP35,36. Au fil des ans, cette famille de rapporteurs a subi plusieurs évolutions pour permettre des lectures distinctes pour des transitoires de calcium particuliers avec une cinétique spécifique (lente, moyenne et rapide), chacune avec des propriétés légèrement ^{différentes37,38}. Ici, l’utilisation du rapporteur GcaMP6 a été mise en évidence, qui a déjà été montré pour détecter les potentiels d’action unique et les transitoires de calcium dendritique dans les neurones à la fois in vivo et di ^vitro37.

Les transitoires calciques dans la région présynaptique déclenchent des événements de fusion des vésicules synaptiques, provoquant la libération de neurotransmetteurs dans la synapse et l’initiation d’événements de signalisation dans la cellule postsynaptique28,39. Les vésicules synaptiques sont à la fois rapidement libérées et recyclées, car la cellule maintient homéostatiquement une surface de membrane cellulaire stable et un pool facilement libérable de vésicules membranaires capables de ^fusion40. Le colorant styryl utilisé ici a une affinité pour les membranes lipidiques et modifie spécifiquement ses propriétés d’émission en fonction de l’ordre de l’environnement lipidique ^{environnant41,42}. C’est donc un outil idéal pour marquer les vésicules synaptiques de recyclage et le suivi ultérieur de ces vésicules telles qu’elles sont libérées plus tard après une stimulation ^{neuronale41,42}. Le protocole qui a été généré et optimisé est une adaptation des concepts décrits initialement par Gaffield et ses collègues, ce qui nous permet de visualiser en continu les puncta de vésicules synaptiques marquées par un colorant styryl au fil du ^temps41.

Ici, deux méthodologies connexes basées sur la fluorescence sont décrites, rapportant de manière fiable des événements cellulaires spécifiques impliqués dans la transmission synaptique. Des protocoles ont été définis pour sonder la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique médié par la dépolarisation et de l’exocytose des vésicules synaptiques dans les neurones en culture. Ici, les méthodes et les résultats représentatifs sont axés sur l’utilisation de corticaux ou de motoneurones primaires de rongeurs comme système de modèle in vitro, car il existe des études publiées utilisant ces types de ^{cellules43,44}. Cependant, ces méthodes sont également applicables aux neurones corticaux ⁱ³ humains ^{différenciés45}, car nous avons également eu du succès avec les deux protocoles dans l’expérimentation actuellement en cours dans notre laboratoire. Le protocole général est décrit dans un format linéaire par étapes, illustré à la figure 1. En bref, pour étudier la dynamique du calcium dans les neurites, les neurones matures sont transfectés avec de l’ADN plasmidique pour exprimer le rapporteur fluorescent GCaMP6m sous un promoteur de cytomégalovirus (CMV)^37,46. Les cellules transfectées ont un faible niveau de fluorescence vert basal, ce qui augmente en présence de calcium. Les régions d’intérêt sont spécifiées pour surveiller les changements de fluorescence tout au long de notre manipulation. Cela permet de mesurer des fluctuations de calcium très localisées dans l’espace et dans le ^temps37,46. Pour évaluer la fusion et la libération des vésicules synaptiques, les neurones matures sont chargés de colorant styryl incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques au fur et à mesure qu’ils sont recyclés, reformés et rechargés en neurotransmetteurs dans les cellules présynaptiques41,42,43,47,48. Les colorants actuels utilisés à cette fin marquent les vésicules synaptiques le long des neurites et sont utilisés comme proxy pour ces régions dans des expériences d’imagerie en direct, comme l’ont montré la co-coloration du colorant styryl et de la synaptotagmine par Kraszewski et ses ^collègues49. Sont incluses ici des images représentatives de taches similaires qui ont également été effectuées (Figure 2A). Des chercheurs antérieurs ont largement utilisé ces colorants pour rapporter la dynamique des vésicules synaptiques à la jonction neuromusculaire et aux neurones de l’hippocampe48,49,50,51,52,53,54,55,56 . En sélectionnant les régions ponctuées des vésicules chargées de colorant et en surveillant les diminutions de l’intensité de fluorescence après la libération des vésicules, la capacité de transmission synaptique fonctionnelle et la dynamique temporelle de libération peuvent être étudiées après ^{stimulation43}. Pour les deux méthodes, un milieu contenant une forte concentration de chlorure de potassium est utilisé pour dépolariser les cellules afin d’imiter l’activité neuronale. Les paramètres d’imagerie sont spécifiés pour capturer des intervalles inférieurs à la seconde couvrant une normalisation de base suivie de notre période de capture de stimulation. Les mesures de fluorescence à chaque point temporel sont déterminées, normalisées à l’arrière-plan et quantifiées au cours de la période expérimentale. L’augmentation de la fluorescence GCaMP6m médiée par l’afflux de calcium ou la diminution efficace de l’exocytose de la vésicule synaptique par la libération de colorant styryl peut être détectée grâce à cette stratégie. La configuration méthodologique détaillée et les paramètres de ces deux protocoles ainsi qu’une discussion sur leurs avantages et leurs limites sont décrits ci-dessous.

Figure 1 : Rendu visuel de l’ensemble du processus général du protocole. (1) Isoler et cultiver les neurones primaires des rongeurs in vitro jusqu’au point de temps de maturation choisi. (2) Introduire l’ADN GCaMP ou le colorant styryl comme rapporteurs de l’activité synaptique. (3) Configurer le paradigme de l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal équipé d’imagerie en direct et du logiciel associé. Commencez la période d’enregistrement de référence. (4) Pendant que les cellules subissent encore une capture d’images en direct, stimulez les neurones via une perfusion de bain KCl élevée. (5) Évaluer les mesures d’intensité de fluorescence au fil du temps pour mesurer les transitoires calciques ou la fusion des vésicules synaptiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les procédures animales effectuées dans le cadre de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Jefferson. 1. Culture primaire de neurones du cortex embryonnaire du rat REMARQUE: Les neurones corticaux primaires sont isolés à partir d’embryons de rats E17.5 comme décrit précédemment57,58. Aucun biais de souche ne se…

Representative Results

Après la mise en œuvre réussie du protocole ci-dessus, des résultats représentatifs sont présentés pour une expérience typique de libération de vésicules synaptiques de colorant styryl. Les neurones corticaux primaires de rats cultivés ont été chargés de colorant à l’aide de la méthode décrite à la rubrique 6. La spécificité de la charge en colorant a été déterminée par co-marquage avec la synaptophysine, marqueur de vésicule synaptique. La majorité des colorants de styryl positifs sont co-pos…

Discussion

Trois étapes communes aux deux méthodes décrites sont d’une importance cruciale pour le succès expérimental et les résultats quantifiables. Tout d’abord, la préparation d’un CSF frais avant chaque série d’expériences est essentielle, en suivant les instructions ci-jointes. Ne pas le faire peut empêcher une dépolarisation neuronale appropriée. Un échantillon de neurones témoins non traités doit être constamment testé avant la stimulation de tout groupe expérimental afin d’assurer une dépolaris…

Materials

20x air objective	Nikon		For imaging
40x oil immersion objective	Nikon		For imaging
B27 supplement	Thermo Scientific	17504044	Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood	Baker	SterilGARD III SG403A	Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148	For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418	For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	223506	Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator	Thermo Scientific	13-998-123	For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For neuronal culture preparation
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti +A1R core	For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera	Photometrics		For image acquisition
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270	Component of aCSF solutions
DNase	Millipore Sigma	D5025	For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats	Charles river	400SASSD	For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube	Nikon	77032509	For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye	Invitrogen	T13320	For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette	Grainger	52NK56	For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Millipore Sigma	H6648	For preparing neuronal cultures
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
horse serum	Millipore Sigma	H1138	For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood	NUAIRE	NU-301-630	For preparing neuronal cultures
Laminin	Thermo Scientific	23017015	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Scientific	11668019	For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride	Millipore Sigma	208337	Component of aCSF solutions
Microsoft Excel	Microsoft		Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium	Thermo Scientific	21103049	For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes	Thermo Scientific	339650	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	For preparing neuronal cultures
Papain	Millipore Sigma	P4762	For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system	Warner Instruments	SF-77B	For exchange of aCSF
Perfusion tubing	Cole-Parmer	UX-30526-14	Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid	Addgene	40754	For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide	Millipore Sigma	P7886	Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761	Component of aCSF solutions
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888	Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator	Tokai Hit		For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube	Nikon	77032809	For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor	Millipore Sigma	T6414	For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table	New Port	VIP320X2430-135520	Table/stand for microscope