Summary

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

Published: August 19, 2021
doi:

Summary

Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.

Abstract

نظم التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة العمليات البيولوجية. يمكن لأنظمة التعبير البصري أن توفر تحكما دقيقا في توقيت التعبير الجيني وموقعه وسعته باستخدام الضوء كعامل محفز. في هذا البروتوكول، يتم استخدام نظام التعبير البصري لتحقيق التعبير الجيني الخفيف القابل للانزدحام في أجنة حمار وحشي. يعتمد هذا النظام على عامل نسخ هندسي يسمى TAEL استنادا إلى عامل نسخ نشط للضوء بشكل طبيعي من بكتيريا E. litoralis. عندما تضيء مع الضوء الأزرق، TAEL dimerizes، يربط إلى عنصرها التنظيمي cognate يسمى C120، وينشط النسخ. يستخدم هذا البروتوكول أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا تعبر عن عامل نسخ TAEL تحت سيطرة مروج ubb في كل مكان. وفي الوقت نفسه، فإن العنصر التنظيمي C120 يدفع التعبير عن جين المراسل الفلوري (GFP). باستخدام لوحة LED بسيطة لتقديم الضوء الأزرق المنشط ، يمكن أولا اكتشاف تحريض تعبير GFP بعد 30 دقيقة من الإضاءة ويصل إلى ذروة التعريفي أكثر من 130 ضعفا بعد 3 ساعة من العلاج الخفيف. يمكن تقييم تحريض التعبير عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ومجهر الفلورسينس. هذه الطريقة هي نهج متعدد الاستخدامات وسهل الاستخدام للتعبير الجيني البصري.

Introduction

تساعد أنظمة التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك في التحكم في كمية التعبير الجيني وتوقيته وموقعه. ومع ذلك، كان تحقيق السيطرة المكانية والزمنية الدقيقة في الكائنات متعددة الخلايا أمرا صعبا. ويتحقق التحكم الزمني الأكثر شيوعا عن طريق إضافة مركبات جزيء صغير1 أو تفعيل المروجين صدمة الحرارة2. ومع ذلك، فإن كلا النهجين عرضة لقضايا التوقيت، وقوة الحث، والاستجابات الإجهادية خارج الهدف. ويتحقق التحكم المكاني بشكل رئيسي باستخدام المروجين3الخاصين بالأنسجة ، ولكن هذا النهج يتطلب مروجا مناسبا أو عنصرا تنظيميا ، وهو غير متوفر دائما ، ولا يؤدي إلى تحريض مستوى الأنسجة الفرعية.

وعلى النقيض من هذه النهج التقليدية، فإن المنشطات البصرية البصرية المنشطة للضوء لديها القدرة على التحكم المكاني والزمني الدقيق في التعبير الجيني4. تم تطوير نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء وتحسينه للاستخدام في أجنة حمار وحشي5،6. ويستند هذا النظام على عامل النسخ ضوء تنشيط الذاتية من البكتيريا E. litoralis7,8. يتكون نظام TAEL/C120 من منشط نسخي يسمى TAEL يحتوي على مجال تحويل Kal-TA4 ، ومجال LOV الأزرق المستجيب للضوء (استشعار الجهد الخفيف الأكسجين) ، ومجال ربط الحمض النووي الحلزوني (HTH)5. عندما مضيئة، والمجالات LOV الخضوع لتغيير تشكيلي يسمح اثنين من جزيئات TAEL لتعتيم، وربط إلى المروج C120 تستجيب TAEL، والشروع في نسخ من جين المصب منالفائدة 5،8. يعرض نظام TAEL/C120 تحريضا سريعا وقويا بأقل قدر من السمية ، ويمكن تنشيطه من خلال العديد من طرائق التسليم الخفيف المختلفة. وفي الآونة الأخيرة، أدخلت تحسينات على نظام TAEL/C120 بإضافة إشارة توطين نووية إلى TAEL (TAEL-N) وباقتران العنصر التنظيمي C120 بجهة تسويق أساسية cFos (C120F)(الشكل 1A). هذه التعديلات تحسين مستويات التعريفي بأكثر من 15 أضعاف6.

في هذا البروتوكول، يتم استخدام لوحة LED بسيطة لتنشيط نظام TAEL/C120 والحث على التعبير في كل مكان عن جين المراسل، GFP. يمكن رصد تحريض التعبير نوعيا من خلال مراقبة كثافة الفلورسينس أو كميا عن طريق قياس مستويات النسخ باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). هذا البروتوكول سوف تظهر نظام TAEL/C120 كأداة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام التي تمكن تنظيم قوي للتعبير الجيني في الجسم الحي.

Protocol

أجريت هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا ميرسيد. 1. عبور حمار وحشي وجمع الأجنة الحفاظ على خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا منفصلة تحتوي إما على المنشط النسخ TAEL أو الجين مراسل C120 التي تسيطر عليها للحد من التنشيط زا…

Representative Results

لهذه المظاهرة ، C120 استجابة GFP خط مراسل (TG (C120F : GFP)ucm107))عبرت مع خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن TAEL – N في كل مكان من ubiquitin ب (ubb) المروج (Tg(ubb:TAEL -N)ucm113))لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحتوي على كلا العنصرين. 24 ساعة بعد الإخصاب، تعرضت الأجنة لتنشيط الضوء الأزرق، نبض…

Discussion

يصف هذا البروتوكول استخدام نظام TAEL/C120 البصري لتحقيق التعبير الجيني الأزرق غير القابل للانخزال. يتكون هذا النظام من منشط النسخ ، TAEL ، الذي يتناقص عند الإضاءة مع الضوء الأزرق وينشط نسخ جين الفائدة في المصب لعنصر تنظيمي C120. يمكن الكشف عن التعبير المستحث لمراسل GFP بعد أقل من 30 دقيقة من التعرض ل?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر ستيفان ماترنا وأعضاء مختبري وو وماتيرانا على الاقتراحات والتعليقات المفيدة على هذا البروتوكول. نشكر آنا ريد وكيفن غاردنر ولورا موتا مينا على المناقشات القيمة والرؤى أثناء تطوير هذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة؛ R03 DK106358) ولجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا (CRN-20-636896) إلى S.W.

Materials

BioRender web-based science illustration tool BioRender https://biorender.com/
Color CCD digital camera Lumenara 755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D
Excitation filter, 545 nm Olympus ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit GE Healthcare 95017-491
Instsant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) Amazon B017GWDF7E
Methylcellulose Sigma-Aldrich M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch Amazon B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix Quantabio 101414-286
Photoshop image procesing software Adobe
Prism graphing and statistics software GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix Quantabio 10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28137
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source Excelitas 010-00326R Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

Riferimenti

  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochimica. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).

Play Video

Citazione di questo articolo
LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. J. Vis. Exp. (174), e62818, doi:10.3791/62818 (2021).

View Video