Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus
Summary
Le présent protocole décrit une méthode permettant de recueillir suffisamment de salive auprès d’insectes perçants-suceurs à l’aide d’un milieu artificiel. Il s’agit d’une méthode pratique pour collecter la salive des insectes et étudier la fonction salivaire sur le comportement alimentaire des insectes et la transmission du virus à transmission vectorielle.
Abstract
Le virus de la bande de riz (VRS), qui cause une perte économique importante de l’agriculture en Asie de l’Est, dépend entièrement des insectes vecteurs pour sa transmission efficace entre le riz hôte. Laodelphax striatellus (petite sauterelle brune, SBPH) est le principal insecte vecteur qui transmet horizontalement le VRS tout en aspirant la sève du phloème. La salive joue un rôle important dans le comportement alimentaire des insectes. Une méthode pratique qui sera utile pour la recherche sur la salive des insectes avec un comportement alimentaire perçant-suceur est décrite ici. Dans cette méthode, les insectes ont été autorisés à se nourrir d’un régime artificiel pris en sandwich entre deux couches de film de paraffine étirées. Le régime alimentaire contenant la salive a été recueilli chaque jour, filtré et concentré pour une analyse plus approfondie. Enfin, la qualité de la salive recueillie a été examinée par coloration protéique et immunobuvardage. Cette méthode a été illustrée par la détection de la présence du VRS et d’une protéine semblable à la mucine dans la salive de l’HBS. Ces méthodes d’alimentation artificielle et de collecte de la salive jetteront les bases de recherches supplémentaires sur les facteurs de la salive des insectes liés au comportement alimentaire et à la transmission du virus.
Introduction
Le virus de la bande de riz (VRS), un virus à ARN à brin négatif du genre Tenuivirus,provoque des maladies graves dans la production de riz en Asie del’Est1,2,3. La transmission du VRS des plants de riz infectés aux plants sains dépend des insectes vecteurs, principalement Laodelphax striatellus, qui transmet le VRS de manière persistante. SBPH acquiert le virus après s’être nourri de plantes infectées par le VRS. Une fois à l’intérieur de l’insecte, le VRS infecte la cellule épithéliale de l’intestin moyen un jour après l’alimentation, puis traverse la barrière de l’intestin moyen pour pénétrer dans l’hémolymphe. Par la suite, le VRS se propage dans différents tissus via l’hémolymphe, puis se propage. Après une période de latence d’environ 10 à 14 jours après l’acquisition, le virus à l’intérieur de la glande salivaire peut être transmis aux plantes hôtes saines via la salive sécrétée tandis que SBPH aspire la sève du phloème4,5,6,7,8,9,10 . Un processus d’alimentation efficace et divers facteurs dans la salive sont essentiels pour la propagation du VRS de l’insecte à la plante hôte.
On pense que la salive d’insecte sécrétée par les glandes salivaires sert de médiateur aux insectes, aux virus et aux plantes hôtes. Les insectes hémiptères produisent généralement deux types de salive: la salive gélifiante et la saliveaqueuse 11,12,13. La salive gélifiante est principalement sécrétée dans l’apoplasme pour soutenir le mouvement du stylet entre les cellules hôtes et est également liée au dépassement de la résistance des plantes et des réponses immunitaires14,15,16,17. Au stade de l’alimentation, les insectes sécrètent par intermittence de la salive gélifiante qui s’oxyde immédiatement pour former une bride de surface. Ensuite, des gaines simples ou ramifiées enveloppent le stylet pour réserver un canal tubulaire18,19,20. La bride de surface sur l’épiderme est supposée faciliter la pénétration du stylet en servant de point d’ancrage, tandis que les gaines autour du stylet peuvent assurer la stabilité mécanique et la lubrification16,21,22,23. Nlshp a été identifié comme une protéine essentielle pour la formation de la gaine salivaire et l’alimentation réussie de la sauterelle brune (Nilaparvata lugens, BPH). L’inhibition de l’expression de la protéine de gaine structurelle (SHP) sécrétée par le puceron Acyrthosiphon pisum a réduit sa reproduction en perturbant l’alimentation à partir des tubes du tamis hôte24. De plus, chez certaines espèces d’insectes, les facteurs de salive en gel sont censés déclencher les réponses immunitaires des plantes en formant des modèles moléculaires dits associés aux herbivores (HAMPs). Chez N. lugens,NlMLP, une protéine semblable à la mucine liée à la formation de gaines, induit des défenses végétales contre l’alimentation, y compris la mort cellulaire, l’expression de gènes liés à la défense et le dépôt de callose 25,26. En outre, il a été prouvé que certains facteurs de salive en gel chez les pucerons déclenchent des réponses de défense des plantes via des interactions gène-à-gène similaires aux modèles moléculaires associés aux agents pathogènes12,15,27.
Pour étudier les facteurs salivaires essentiels à l’alimentation des insectes et / ou à la transmission des agents pathogènes, il est nécessaire d’analyser la salive sécrétée. Ici, les méthodes d’alimentation artificielle et de collecte pour obtenir des quantités suffisantes de salive sont décrites pour une analyse plus approfondie. En utilisant un milieu ne contenant qu’un seul élément nutritionnel, de nombreuses protéines salivaires ont été collectées et analysées par coloration à l’argent et western blotting. Cette méthode sera utile dans d’autres recherches sur les facteurs de la salive qui sont essentiels à la transmission du VRS par SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’élevage réussi d’insectes sur des régimes artificiels a été signalé pour la première fois en 1962 lorsque Mittler et Dadd ont décrit la technique de la membrane de paraffine pour tenir un régime artificiel29,30. Et cette méthode a été explorée dans de nombreux aspects de la biologie et du comportement des insectes, par exemple, le supplément nutritif, l’alimentation en ARNd et l’acquisition de virus. Sur la base des exigences de l’analys…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program of China (n° 2019YFC1200503), par la National Science Foundation of China (n° 32072385) et par la Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
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