Il presente protocollo descrive un metodo per raccogliere una quantità sufficiente di saliva dagli insetti che succhiano il piercing usando un mezzo artificiale. Questo è un metodo conveniente per raccogliere la saliva degli insetti e studiare la funzione salivare sul comportamento di alimentazione degli insetti e sulla trasmissione del virus trasmesso da vettori.
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Articolo metodologico
Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il virus della striscia di riso (RSV), che causa una significativa perdita economica dell'agricoltura in Asia orientale, dipende interamente dagli insetti vettori per la sua efficace trasmissione tra il riso ospite. Laodelphax striatellus (piccola planthopper marrone, SBPH) è il principale insetto vettore che trasmette orizzontalmente RSV mentre succhia la linfa dal floema. La saliva svolge un ruolo significativo nel comportamento alimentare degli insetti. Un metodo conveniente che sarà utile per la ricerca sulla saliva degli insetti con comportamento alimentare piercing-sucking è descritto qui. In questo metodo, agli insetti è stato permesso di nutrirsi di una dieta artificiale inserita tra due strati di film di paraffina allungati. La dieta contenente la saliva è stata raccolta ogni giorno, filtrata e concentrata per ulteriori analisi. Infine, la qualità della saliva raccolta è stata esaminata mediante colorazione proteica e immunoblotting. Questo metodo è stato esemplificato rilevando la presenza di RSV e di una proteina simile alla mucina nella saliva di SBPH. Questi metodi di alimentazione artificiale e di raccolta della saliva getteranno le basi per ulteriori ricerche sui fattori nella saliva degli insetti legati al comportamento alimentare e alla trasmissione del virus.
Introduzione
Il virus della striscia di riso (RSV), un virus a RNA a filamento negativo nel genere Tenuivirus,causa gravi malattie nella produzione di riso in Asia orientale1,2,3. La trasmissione di RSV da piante di riso infette a quelle sane dipende da insetti vettori, principalmente Laodelphax striatellus, che trasmette RSV in modo persistente-propagativo. SBPH acquisisce il virus dopo essersi nutrito di piante infette da RSV. Una volta all'interno dell'insetto, RSV infetta la cellula epiteliale dell'intestino medio un giorno dopo l'alimentazione e poi passa attraverso....
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Protocollo
1. Manutenzione SBPH
- Allevare gli individui SBPH virulifero e privi di RSV in un incubatore di vetro (65 x 200 mm) con 5-6 piantine di riso(Oryza sativa cv. Nipponbare) per camera di vetro in laboratorio. Coltivare le piante di riso a 25 °C sotto un fotoperiodo luminoso di 16 ore / 8 ore di buio.
NOTA: Gli individui SBPH viruliferosi e privi di RSV sono stati inizialmente catturati nella provincia di Jiangsu, in Cina. - Rileva l'RSV in SBPH mediante un saggio immunoassorbinte legato a punti enzimatici (dot-ELISA) con un anticorpo policlonale RSV specifico per coniglio (vedi Tabella dei materiali)sollevato contro le ribonu....
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Risultati
Schemi di installazione di alimentazione artificiale e raccolta della saliva
La figura 1A raffigura il cilindro di vetro (15 cm x 2,5 cm) utilizzato come camera di alimentazione per raccogliere la saliva. In primo luogo, le larve SBPH sono state affamate per diverse ore per migliorare l'efficienza di raccolta e poi immobilizzate raffreddando per 5 minuti. Dopo che gli insetti sono stati trasferiti nel cilindro di vetro, entrambe le estremità aperte della camera sono state.......
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Discussione
Il successo dell'allevamento di insetti con diete artificiali è stato segnalato per la prima volta nel 1962 quando Mittler e Dadd hanno descritto la tecnica della membrana di paraffina per tenere una dieta artificiale29,30. E questo metodo è stato esplorato in molti aspetti della biologia e del comportamento degli insetti, ad esempio l'integrazione di nutrienti, l'alimentazione di dsRNA e l'acquisizione di virus. Sulla base dei requisiti dell'analisi della saliva.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2019YFC1200503), dalla National Science Foundation of China (n. 32072385) e dalla Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtro centrifugo 10-KD | Merck Millipore | R5PA83496 | Per la concentrazione |
| 10x Tampone di trasferimento proteico (umido) | macGENE | MP008 | Tampone di trasferimento per western blotting |
| 10x tampone TBST | Coolaber | SL1328-500mL&volte; 10 | Wash Buffer per western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Sistema di imaging per western blotting e colorazione con argento |
| Scala proteica prestained a colori | GenStar | M221-01 | Marcatore proteico per western blotting |
| ECL reagenti per la rilevazione del western blotting | GE Healthcare | RPN2209 | rilevazione del western blotting |
| cromogenico HRP-DAB potenziato | TIANGEN | Reazione cromogenica | |
| Anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano | Sigma | 401393-2ML | Anticorpo secondario policlonale per western blotting |
| Immobilon(R)-P Membrana polivinilide difluoruro | Merck Membrana | di trasferimento IPVH00010 | per western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | Per PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | Per PCR trascrizionale inversa (RT-PCR) |
| Filtro Millex-GP, 0,22 e micro; m | Merck Millipore | SLGP033RB | Per filtrazione |
| Mini-PROTEAB TGX Gel | Bio-Rad | 4561043 | Per SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Rilevamento della concentrazione di proteine |
| Membrana in nylon | PALL | T42754 | Membrana per dot-ELISA |
| Parafilm M Membrana | Sigma | P7793-1EA | Produzione di dieta artificiale sandwich |
| Anticorpo policlonale anti-LssgMP di coniglio contro i peptidi LssgMP | Genstript | Anticorpo policlonale primario anti-LssgMP di coniglio per western blotting | |
| Anticorpo policlonale anti-RSV di coniglio | Genstript | Anticorpo policlonale primario anti-RSV di coniglio per western blotting e microkit puro dot-ELISA | |
| RNAprep | TIANGEN | DP420 | per l'estrazione dell'RNA |
Riferimenti
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....
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Ristampe e permessi
