Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.
Neutrofielen (PMN’s) zijn de meest voorkomende leukocyten in de menselijke circulatie, variërend van 40 tot 70% van de totale bloedleukocyten. Het zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd op de plaats van ontsteking via snelle extravasatie door bloedvaten. Daar voeren neutrofielen een reeks functies uit om binnendringende pathogenen te doden en immuunsignalering te bemiddelen. Vers gezuiverde neutrofielen uit menselijk bloed zijn het model bij uitstek voor onderzoek, omdat geen enkele cellijn PMN-functies en biologie volledig repliceert. Neutrofielen zijn echter kortlevende, terminaal gedifferentieerde cellen en zijn zeer gevoelig voor activering als reactie op fysieke (temperatuur, centrifugatiesnelheid) en biologische (endotoxine, chemo- en cytokines) stimuli. Daarom is het cruciaal om een gestandaardiseerde, betrouwbare en snelle methode te volgen om zuivere en niet-geactiveerde cellen te verkrijgen. Dit protocol presenteert een bijgewerkt protocol dat dichtheidsgradiëntcentrifugatie, sedimentatie van rode bloedcellen (RBC) en RBC-lysis combineert om een hoge PMN-zuiverheid te verkrijgen en celactivering te minimaliseren. Bovendien worden ook methoden besproken om de kwaliteit, levensvatbaarheid en zuiverheid van neutrofiele isolatie te beoordelen.
Het aangeboren immuunsysteem bestaat uit vele celtypen die immuunhomeostase en pathogeenklaring handhaven, samen met vele andere fysiologische functies. Neutrofielen vormen de grootste pool van witte bloedcellen in de menselijkecirculatie 1. De meeste volwassen neutrofielen worden opgeslagen in het beenmerg, dat de plaats is van generatie voor nieuwe neutrofielen, ook wel granulopoiese genoemd. In het beenmerg verlaten granulocytenvoorlopers de celcyclus en differentiëren terminaal, het verkrijgen van hun karakteristieke gesegmenteerde kernen enkorrels 2. Onder inflammatoire omstandigheden, als reactie op chemokines, cytokines en schade-geassocieerde en pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, worden neutrofielen gemobiliseerd uit de bloedbaan en uit het beenmerg om een breed scala aan functies uit te voeren. Deze omvatten cytokinecretie, directe fagocytose van het pathogeen, de afgifte van reactieve zuurstofsoorten, degranulatie van antimicrobiële eiwitten en de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen.
De moleculen die neutrofielen gebruiken om infecties te bestrijden, zijn giftig voor de microben en de gastheer. De levensduur en de juiste verwijdering van ouder wordende / stervende neutrofielen zijn dus sterk gereguleerd en ze hebben een beperkte levensduur in omloop (<48 uur)3. Vanwege deze korte overleving produceert het menselijk lichaam dagelijks gemiddeld 100 miljard nieuwe neutrofielen om de homeostase van de bevolking te handhaven4. Noodgranulopoiese kan de afgifte van neutrofielen, zowel volwassen als onvolwassen, in het bloed verder verhogen tijdens ontsteking en infectie5. Het belang van neutrofielen in de aangeboren immuunrespons wordt benadrukt door patiënten met verworven of aangeboren neutropenie, die vatbaar zijn voor bacteriële en schimmelinfecties6.
Veel uitdagingen doen zich voor bij het bestuderen van neutrofielenbiologie en hun rol in de immuunrespons vanwege hun aard, inclusief hun korte overleving en cytotoxische inhoud. Neutrofielachtige cellijnen zijn vaak gedifferentieerd van menselijke promyelocytaire leukemie HL-60-cellen en PLB-985-cellen7,8. Hoewel ze neutrofielachtige morfologie kunnen vertonen en chemotaxis kunnen uitvoeren, kunnen deze cellijnen de biologie van neutrofielen niet volledig samenvatten. In vitro assays met behulp van deze cellijnen zijn ook niet in staat om in vivo experimenten samen te vatten. Bovendien moet de differentiatie van deze cellen worden geïnduceerd en kan deze nadelig worden beïnvloed door genmanipulatie vóór differentiatie.
Onlangs zijn methoden ontwikkeld om deze problemen te omzeilen door induceerbare promotors te gebruiken om genexpressie postdifferentiatie in HL-60-cellen te moduleren9. Zelfs met dergelijke hulpmiddelen zijn primaire menselijke PMN’s vereist om doelen te valideren met behulp van farmacologische benaderingen. Het is dus noodzakelijk om zuivere en geïnactiveerde neutrofielen geïsoleerd uit bloed te verkrijgen om de bevindingen van cellijn- en diermodellen te valideren. Dit artikel presenteert een herzien PMN-isolatieprotocol waarin de voor- en nadelen van de huidige methoden werden geëvalueerd10. Er werd een combinatie bedacht bestaande uit gradiëntcentrifugatie om PMN’s te scheiden van andere immuuncellen, korte sedimentatie op basis van dextran om het grootste deel van de RBC’s te verwijderen, snelle resterende RBC-lysis via osmotische druk en centrifugering met lage snelheid om bloedplaatjesbesmetting te verwijderen.
Vanwege de korte levensduur, terminale differentiatiestatus en lytische inhoud van neutrofielen, is het bestuderen van deze cellen altijd een uitdaging geweest. Afgezien van het gebruik van muismodellen of cellen uit patiëntencohorten, zijn cellijnen nuttige hulpmiddelen om neutrofielenbiologie te helpenbestuderen 16. Neutrofielachtige cellijnen kunnen echter niet alle aspecten van de neutrofiele biologie volledig herhalen, waardoor een extra laag van moeilijkheid wordt toegevoegd bij het bestuderen van deze cellen. Het meest gebruikte in vitro model is de HL-60 cellijn, die kan worden gedifferentieerd in neutrofiel-achtige cellen door behandeling met dimethylsulfoxide of retinoïnezuur17,18. Hoewel deze cellen nuttig zijn bij de studie van migratie en respiratoire burst, zijn ze niet geschikt voor het bestuderen van de microbiocidale activiteit van neutrofielen. Andere cellijnen bestaan (PLB-98, NB4), en ze zijn ook geassocieerd met hun set van beperkingen19.
Het is cruciaal om te valideren met primaire menselijke neutrofielenwaarnemingen gemaakt met muisziektemodellen en cellijnen. Neutrofielen kunnen niet efficiënt worden gecryopreserveerd en worden daarom vaak vers geïsoleerd uit volbloed of buffy coats verkregen van donoren en onmiddellijk verwerkt. Eenmaal geïsoleerd, beginnen de cellen een complexe vorm van spontane dood te ondergaan, gereguleerd door oxidatie, cytoplasmatische caspasen en proteasen gevonden in neutrofielenkorrels20,21. Onjuiste isolatiemethoden of -technieken kunnen leiden tot de activering van neutrofielen, waardoor de celondergang alleen maar wordt versneld. Het is absoluut noodzakelijk om een betrouwbare en consistente methode te hebben om zuivere en hoogwaardige neutrofielen van donoren te verkrijgen.
Er zijn veel methoden gepubliceerd over menselijke neutrofiele isolatie10,22. Ze vallen voornamelijk in twee categorieën, met enkele gedeelde strategieën. De eerste categorie is gebaseerd op antilichamen, hetzij door positieve of negatieve selectie. Positieve selectie zou neutrofielen direct labelen, waardoor een zeer zuivere celpopulatie wordt geboden, hoewel het ook leidt tot snelle celactivering, celdood en ongewenste tagging van neutrofielen23. Negatieve selectie, hoewel de cellen ongelabeld bleven en een zeer zuivere populatie gaven, versnelde neutrofiele dood, hoewel het precieze mechanisme onbekend is(figuur 5). Of gen- of eiwitexpressie ook verandert na positieve of negatieve selectie moet verder worden onderzocht. Bovendien, vanwege de hoeveelheid antilichaam die nodig is om de andere soorten cellen uit te putten, kunnen deze methoden geen grote hoeveelheden neutrofielen produceren. Op antilichamen gebaseerde assays kunnen echter nog steeds worden gebruikt voor kortetermijnkweek en experimenten op kleinere schaal en zijn methoden bij uitstek voor experimenten die een zeer hoge celzuiverheid vereisen, zoals gen- en eiwitexpressiestudies.
Het tweede type isolatiemethode is gradiënt- en dichtheidsgebaseerd. Het gaat meestal om Percoll, Ficoll-Paque of andere polysaccharide / polyvinylpyrrolidoncomponenten en maakt gebruik van centrifugatiekracht om verschillende soorten bloedcellen te scheiden op basis van celdichtheid. Deze methoden worden vaak aangevuld met de sedimentatie van rode bloedcellen door dextran. Deze methoden kunnen grotere schalen van uitgangsmateriaal aan en kunnen ook een hoge zuiverheid bereiken. Een voorbehoud van op dichtheid gebaseerde isolatie is de inefficiënte scheiding van andere veel minder overvloedige granulocyten (meestal eosinofielen) van neutrofielen, en het is daarom de belangrijkste beperking van het gepresenteerde protocol, omdat zelfs de aanwezigheid van kleincellige besmetting de neutrofielenrespons kan beïnvloeden24.
Hier gepresenteerd is een samengevatte methode op basis van gradiëntisolatie, waarbij eerdere methoden10,22wordenverfijnd. We gebruiken de huidige onderschatting van neutrofiele specificiteiten om op betrouwbare wijze zuivere menselijke neutrofielen te isoleren met beperkte resterende bloedplaatjes en RBC’s, waardoor neutrofielenactivatie en versnelde dood worden voorkomen. De meest cruciale stap is de gelaagdheid van de gradiënt, die veel effectiever wordt verkregen door het dichtheidsgradiëntmedium onder het bloed toe te voegen om een scherpe interface te verkrijgen. Een snel onderzoek van de PBMC-ring en de gradiënt na centrifugeren kan mogelijke verontreiniging, activering en lage opbrengsten aan het licht brengen. Bij het werken met een leukaferesemembraan of buffy coat is het verdunnen van het bloed belangrijk omdat overmatige celdichtheid zou leiden tot celaggregatie, wat zou leiden tot onzuiverheden en celactivering.
Dit protocol moet binnen 2 uur worden voltooid om de versheid van de cel te garanderen en stappen met betrekking tot het dichtheidsgradiëntmedium, dextran en lysis moeten onmiddellijk worden uitgevoerd, omdat blootstelling aan deze oplossingen neutrofielen kan veranderen. Met dit protocol is de verwachte opbrengst van neutrofielen ten minste ~ 10 miljoen / 10 ml volbloed en ten minste ~ 60 miljoen / 10 ml buffy coat. Evaluatie van de isolatiekwaliteit moet als volgt worden uitgevoerd: geactiveerde neutrofielen moeten minder dan 10% zijn, lymfocytenbesmetting lager dan 5%, minimale eosinofiel (dezelfde zijdelingse scatter maar lagere voorwaartse scatterpopulatie) en de levensvatbaarheid van cellen moet meer dan 90% zijn. Lagere zuiverheid kan het gevolg zijn van onjuiste gelaagdheid of opslag van het dichtheidsgradiëntmedium of vanwege de kwaliteit en versheid van het startbloedproduct.
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd ondersteund door P01HL095489. A.Y.H werd ondersteund door T32HL066987.
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
CD41-APC | biolegend | 303710 | |
Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
Dextran | Fisher | BP1580 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium chloride | sigma | 71376 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |