Undersøker migrenelignende oppførsel ved hjelp av lysaversjon hos mus

Summary

Gnagere er ikke i stand til å rapportere migrene symptomer. Her beskriver vi et håndterbart testparadigme (lyse/mørke og åpne feltanalyser) for å måle lysaversjon, et av de vanligste og plagsomme symptomene hos pasienter med migrene.

Abstract

Migrene er en kompleks nevrologisk lidelse preget av hodepine og sensoriske abnormiteter, som overfølsomhet overfor lys, observert som fotofobi. Selv om det er umulig å bekrefte at en mus opplever migrene, kan lysaversjon brukes som en atferdssurrogate for migrenesymptomet på fotofobi. For å teste for lysaversjon bruker vi den lyse/mørke analysen til å måle tiden mus fritt velger å bruke i enten et lyst eller mørkt miljø. Analysen har blitt raffinert ved å innføre to kritiske modifikasjoner: preeksponeringer for kammeret før du kjører testprosedyren og justerbar kammerbelysning, slik at bruk av en rekke lysintensiteter fra 55 lux til 27,000 lux. Fordi valget om å tilbringe mer tid i mørket også indikerer angst, bruker vi også en lysuavhengig angsttest, den åpne feltanalysen, for å skille angst fra lys-aversiv oppførsel. Her beskriver vi et modifisert testparadigme for de lyse/mørke og åpne feltanalysene. Anvendelsen av disse analysene er beskrevet for intraperitoneal injeksjon av calcitonin genrelatert peptid (CGRP) i to musestammer og for optogenetiske hjernestimuleringsstudier.

Introduction

Migrene er en utbredt nevrologisk sykdom, som rammer omtrent 17% av ^{amerikanerne1} og er den nest ledende årsaken til funksjonshemming ^globalt2,3. Pasienter opplever hodepine som varer 4-72 timer ledsaget av minst ett av følgende symptomer: kvalme og /eller oppkast, eller fotofobi og ^fonofobi4. Nylige fremskritt i utviklingen av calcitonin gen-relaterte peptid (CGRP) antistoffer som nå er FDA godkjent har begynt en ny epoke for migrene ^{behandling5,6,7}. Disse antistoffene blokkerer enten CGRP eller dens reseptor og forhindrer migrene symptomer hos ca. 50% av migrene ^pasienter7. I løpet av det siste året har to småmolekylantagonister av CGRP-reseptoren også blitt FDA-godkjent for abortiv behandling av migrene, og to til er i ^{rørledningen8}. Til tross for denne terapeutiske fremgangen forblir mekanismer som migreneangrep forekommer fortsatt unnvikende. Områdene for CGRP-handlingen er for eksempel ikke kjent. Effekten av terapeutiske antistoffer som ikke setter pris på å krysse blod-hjernebarrieren antyder at CGRP virker på perifere steder, for eksempel meningene og / eller trigeminale ganglia. Vi kan imidlertid ikke utelukke sentrale handlinger ved omkretsorganer, som mangler en blod-hjernebarriere9. I det minste for fotofobi tror vi dette er mindre sannsynlig gitt våre resultater med lett aversjon ved hjelp av transgene nestin / hRAMP1 mus der hRAMP1 er overekspressert i ^nervevevet10. Forståelse av mekanismer for migrene patofysiologi vil gi nye veier til utvikling av migrene terapeutiske.

Prekliniske dyremodeller er avgjørende for å forstå sykdomsmekanismer og utvikling av nye legemidler. Migrenevurdering hos dyr er imidlertid utfordrende siden dyr ikke verbalt kan rapportere sine følelser av smerte. Gitt det faktum at 80-90% av migrenepasienter viser ^fotofobi11, anses lysaversjon å være en indikator på migrene i dyremodeller. Dette førte til behovet for å utvikle en analyse for å vurdere lysaversjon hos mus.

Den lyse/mørke analysen inneholder en lyssone og en mørk sone. Det er mye brukt til å måle angst hos mus basert på deres spontane utforskning av nye miljøer som motvirkes av deres medfødte aversjon mot ^lys12. Noen studier satte 1/3 av kammeret som den mørke sonen, mens andre satte 1/2 av kammeret som den mørke sonen. Den tidligere innstillingen brukes ofte til å oppdage ^angst13. Selv om vi i utgangspunktet valgte like store lyse/mørke kamre, har vi ikke sammenlignet de to relative størrelsene. Vi kan kommentere at den totale størrelsen på begge kamrene ikke er en viktig faktor siden den første ^testboksen14 var betydelig større enn det påfølgende ^apparatet15, men resultatene var i hovedsak de samme.

To kritiske modifikasjoner på denne lyse/mørke analysen for å vurdere lysaversjon var: testtilstanden og lysintensiteten (figur 1). For det første er mus forututinntatt for det lyse/mørke kammeret for å redusere utforskende ^stasjon16 (figur 1A). Nødvendigheten og tidene for preeksponeringer avhenger av musestammer og modeller. Wildtype C57BL/6J-mus krever vanligvis to ^{preeksponeringer10}, mens bare én preeksponering for CD1-mus er ^{tilstrekkelig17}. På denne måten kan lys-aversiv oppførsel bli umaskert i disse to musestammene. For det andre har kammerbelysningen blitt tilpasset å inkludere et justerbart utvalg av lysintensiteter fra dim (55 lux) til lys (27,000 lux) hvor 55 lux er sammenlignbar med en mørk overskyet dag, og 27,000 lux er sammenlignbar med en lys solrik dag i ^skyggen10. Vi har funnet ut at den nødvendige lysintensiteten varierer med belastning og genetisk modell. Av denne grunn bør enkeltpersoner først vurdere minimum lysintensitet for deres eksperimentelle paradigme.

Selv med disse modifikasjonene på analysen, som kan avsløre en lett-aversiv fenotype, er det nødvendig å teste angstlignende oppførsel for å skille mellom lysaversjon på grunn av lys alene kontra på grunn av angst. Den åpne feltanalysen er en tradisjonell måte å måle angst basert på spontan utforskning av nye miljøer. Det skiller seg fra den lyse/ mørke analysen ved at den utforskende stasjonen motvirkes av den medfødte aversjon mot ubeskyttede åpne områder. Både midten og kantene på kammeret er i lyset, så den åpne feltanalysen er en lysuavhengig angstanalyse. Dermed gjør kombinasjonen av de lyse / mørke og åpne feltanalysene oss i stand til å skille mellom lysaversjon på grunn av en unngåelse av lys kontra en generell økning i angst.

CGRP er et multifunksjonelt nevropeptid som regulerer vasodilatasjon, nociception og ^betennelse18. Det er mye uttrykt i perifere og sentrale nervesystemer. Det spiller en viktig rolle i migrene patofysiologi18. Mekanismen som ligger til grunn for CGRP-virkningen i migrene er imidlertid uklar. Ved å bruke de lyse/mørke og åpne feltanalysene med dette modifiserte testparadigmet kunne vi identifisere lysvillig oppførsel hos mus etter perifer ^10,16 (figur 2) og ^{sentral14,15,16,19} CGRP-administrasjon. I tillegg til nevropeptider er identifisering av hjerneregioner involvert i lett aversjon også viktig for å forstå migrene patofysiologi. De bakre thalamic kjernene er en integrerende hjerneregion for smerte og ^{lysbehandling19}, og thalamus aktiveres under ^migrene20. Dermed målrettet vi bakre thalamic kjerner ved å injisere adeno-assosiert virus (AAV) som inneholder channelrhodopsin-2 (ChR2) eller eYFP i denne regionen. Ved å kombinere denne optogenetiske tilnærmingen med disse to analysene, demonstrerte vi at optisk stimulering av ChR2-uttrykkende nevroner i de bakre thalamiske kjernene induserte ^{lysaversjon19} (figur 3). I dette eksperimentet, gitt den dramatiske effekten på den fremkalte lysaversjon i disse optogenetisk manipulerte musene, ble preeksponeringer for kammeret hoppet over.

Protocol

Dyreprosedyrer ble godkjent av University of Iowa Animal Care and Use Committee og utført i samsvar med standardene fastsatt av National Institutes of Health. 1. Lys/mørk analyse Lys/mørkt kammerapparat (se Materialbord) oppsett. Alt utstyret i denne delen er kommersielt tilgjengelig. På en hylle plasserer du det lyddemperende avlukket (innvendig: 59,7 x 38 x 35,6 cm i B x H x D) som inneholder en uttrekksskuff for enkel tilgang til kammeret og mørk inns…

Representative Results

Dette atferdsmessige testparadigmet er designet for å teste lys-aversiv oppførsel. Det kan utføres ved hjelp av både naive wildtype mus og optogenetiske mus for å undersøke lysaversjon i sanntid under stimulering av en målrettet nevron populasjon. Denne prosedyren har blitt brukt til å studere effekten av perifer CGRP-behandling i CD1- og C57BL/6J-mus10,16 og optisk stimulering av nevroner i de bakre thalamic kjernene i C57BL/6J mus19 på lys-aversiv oppførsel….

Discussion

Den lyse/mørke analysen er mye brukt til å vurdere angstlignende ^atferd12. Analysen er avhengig av medfødt aversjon av mus til lys og deres drivkraft for å utforske når de plasseres i et nytt miljø (lyssone). Men som vi rapporterer her, kan denne analysen også brukes til å vurdere lys-aversiv oppførsel også.

Det er viktig å vurdere antall og nødvendighet av preeksponering før testing. Dette avhenger av musens belastning eller modell. For eksempel, i vår ly…

Materials

Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256