Här presenteras ett experimentellt arbetsflöde som möjliggör detektion av caspase-8-bearbetning direkt vid det dödsframkallande signalkomplexet (DISC) och bestämmer sammansättningen av detta komplex. Denna metodik har breda tillämpningar, från att riva upp de molekylära mekanismerna för celldödsvägar till dynamisk modellering av apoptosnätverk.
Extrinsisk apoptos förmedlas av aktivering av dödsreceptorer (DR) såsom CD95/Fas/APO-1 eller tumörnekrosfaktorrelaterad apoptos-inducerande ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av dessa receptorer med deras cognate ligands leder till monteringen av det dödsframkallande signalkomplexet (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-associerat protein med dödsdomän (FADD), procaspases-8/-10 och cellulära FADD-liknande interleukin (IL)-1β-konvertera enzymhämmande proteiner (c-FLIPs). DISC fungerar som en plattform för procaspase-8 bearbetning och aktivering. Den senare sker via dess dimerization/oligomerization i död verkställer domänen (DED) filament monterade på DISC.
Aktivering av procaspase-8 följs av dess bearbetning, som sker i flera steg. I detta arbete beskrivs ett etablerat experimentellt arbetsflöde som möjliggör mätning av DISC-bildning och bearbetning av procaspase-8 i detta komplex. Arbetsflödet är baserat på immunoprecipitationstekniker som stöds av western blot analys. Detta arbetsflöde möjliggör noggrann övervakning av olika steg av procaspase-8 rekrytering till DISC och dess bearbetning och är mycket relevant för att undersöka molekylära mekanismer för extrinsic apoptos.
En av de bäst studerade dödsreceptorerna (DR) är CD95 (Fas, APO-1). Den extrinsiska apoptotiska vägen börjar med interaktionen mellan DR och dess cognate ligand, dvs CD95L interagerar med CD95 eller TRAIL binder till TRAIL-Rs. Detta resulterar i bildandet av skivan vid motsvarande DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP proteiner1,2. Dessutom monteras skivan genom interaktioner mellan DD-innehållande proteiner (Death Domain) som CD95 och FADD, och DED-innehållande proteiner som FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP (figur 1). Procaspase-8 genomgår oligomerization via associering av dess DED, vilket resulterar i bildandet av DED filament, följt av procaspase-8 aktivering och bearbetning. Detta utlöser en kaskadkad, vilket leder till celldöd (figur 1)3,4. Procaspase-8 är således en central initiator caspase av extrinsic apoptos utbildningsavsnitt medierad av CD95 eller TRAIL-Rs, aktiveras på motsvarande makromolekylära plattform, DISC.
Två isoformer av procaspase-8, nämligen procaspase-8a (p55) och -8b (p53), är kända för att rekryteras till DISC5. Båda isoformerna består av två DED. DED1 och DED2 finns vid N-terminaldelen av procaspase-8a/b följt av de katalytiska p18- och p10-domänerna. Detaljerad kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analys av procaspase-8 DEDs visade monteringen av procaspase-8 proteiner i filamentösa strukturer som kallas DED filament4,6. Anmärkningsvärt, den linjära procaspase-8 kedjor föreslogs ursprungligen att vara engagerad i dimerization följt av procaspase-8 aktivering på DISC. Det är nu känt att dessa kedjor bara är en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, den senare består av tre kedjor monterade i en trippel helix3,4,6,7.
Vid dimerisering vid DED-filamentet leder konformationsförändringar i procaspase-8a/b till bildandet av det aktiva mitten av procaspase-8 och dess aktivering3,8. Detta följs av procaspase-8-bearbetning, som förmedlas via två vägar: den första går via generering av en p43/ p41 klyvningsprodukt och den andra via den första generationen av en p30 klyvningsprodukt. P43/p41-vägen initieras genom klyvning av procaspase-8a/b vid Asp374, vilket resulterar i p43/p41 och p12 klyvningsprodukter(figur 2). Vidare är dessa fragment automatiskt katalytiskt klyvade vid Asp384 och Asp210/216, vilket ger upphov till bildandet av den aktiva caspase-8 heterotetramer, p102/ p1829,10,11. Dessutom visade det sig att parallellt med p43/p41-bearbetningsvägen klyvs även procaspase-8a/b vid Asp216, vilket leder till bildandet av C-terminalens klyvningsprodukt p30, följt av dess proteolys till p10 och p1810 (figur 2).
Procaspase-8a/b aktivering vid DED-filamentet regleras strikt av proteiner som heter c-FLIPs12. C-FLIP-proteinerna förekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS) och c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alla tre isoformerna innehåller två DEDs i deras N-terminal region. c-FLIPL har också en C-terminal katalytiskt inaktiv caspase-liknande domän12,13. Båda korta isoformerna av c-FLIP-c-FLIPS och c-FLIPR-verkar på ett antiapoptotiskt sätt genom att störa DED-filamentbildningen vid DISC6,14,15. Dessutom kan c-FLIPL reglera caspase-8 aktivering på ett koncentrationsberoende sätt. Detta kan resultera i både pro- och anti-apoptotiska effekter16,17,18. Genom att bilda den katalytiskt aktiva procaspase-8/c-FLIPL heterodimer leder c-FLIPL till stabilisering av det aktiva centrumet av procaspase-8 och dess aktivering. Den pro- eller antiapoptotiska funktionen hos c-FLIPL är direkt beroende av dess mängd vid DED-filamenten och den efterföljande mängden monterade procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Låga eller mellanliggande koncentrationer av c-FLIPL vid DISC resulterar i tillräckliga mängder procaspase-8/c-FLIPL heterodimerer vid DED-filamentet, vilket stöder aktivering av caspase-8. Däremot leder ökade mängder c-FLIPL direkt till dess anti-apoptotiska effekter vid DISC20.
Sammantaget är aktivering och bearbetning av procaspase-8a/b vid DISC en starkt reglerad process som omfattar flera steg. Detta dokument diskuterar mätningen av procaspase-8 bearbetning direkt på DISC samt analysen av sammansättningen av detta komplex. Detta kommer att presenteras med CD95 DISC som det exemplariska DR-komplexet.
Detta tillvägagångssätt beskrevs först av Kischkel et al.27 och har framgångsrikt utvecklats sedan dess av flera grupper. Flera viktiga frågor måste övervägas för effektiv DISC-immunoprecipitation och övervakning caspase-8 bearbetning i detta komplex.
För det första är det viktigt att följa alla tvättsteg under immunoprecipitation. Särskilt viktiga är de sista tvättstegen i sefarospärlorna och torkningen av sefarospärlor. Detta måste göras korrekt…
The authors have nothing to disclose.
Vi uppmärksammar Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansierat av EU-programmet ERUF (Europeiska regionala utvecklingsfonden) och DFG (LA 2386) för att stödja vårt arbete. Vi tackar Karina Guttek för att hon stöttar våra experiment. Vi bekräftar prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) för att ge oss primära T-celler.
12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
APS | Carl Roth | 9592.3 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
Power Pac HC | Bio Rad | ||
Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
scraper | VWR | 734-2602 | |
SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
shaker | Heidolph | ||
sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |