Dette er en tilpasset metode til at identificere kandidat insekt kolonisering faktorer i en Burkholderia gavnlig symbiont. Billeværten er inficeret med et tilfældigt mutantbibliotek genereret via transposon mutagenese, og bibliotekets kompleksitet efter kolonisering sammenlignes med en kontrol dyrket in vitro.
Udlede funktionen af gener ved at manipulere deres aktivitet er et vigtigt redskab til at forstå de genetiske fundamenter af de fleste biologiske processer. Fremskridt inden for molekylær mikrobiologi har set fremkomsten af forskellige mutagenese teknikker til manipulation af gener. Blandt dem er transposon-indsættelse sekventering (Tn-seq) et værdifuldt værktøj til samtidig at vurdere funktionaliteten af mange kandidat gener i en uformålt måde. Teknikken har været nøglen til at identificere molekylære mekanismer til kolonisering af eukaryote værter i flere patogene mikrober og et par gavnlige symbionter.
Her er Tn-seq etableret som en metode til at identificere koloniseringsfaktorer i en mutualistisk Burkholderia gladioli symbiont af billen Lagria villosa. Ved bøjning udføres Tn5 transposon-medieret indsættelse af en antibiotikaresistenskassette på tilfældige genomiske steder i B. gladioli. For at identificere effekten af genforstyrrelser på bakteriernes evne til at kolonisere billeværten podes det genererede B. gladioli transposon-mutant bibliotek på billeægene, mens en kontrol dyrkes in vitro i et flydende kulturmedium. Efter at have givet tilstrækkelig tid til kolonisering, dna er udvundet fra in vivo og in vitro dyrkede biblioteker. Efter en DNA-bibliotek forberedelse protokol, dna-prøverne er forberedt til transposon-indsættelse sekventering. DNA-fragmenter, der indeholder transposon-insert kant og flankerende bakteriel DNA er valgt, og mutation steder bestemmes ved sekventering væk fra transposon-insert kant. Endelig, ved at analysere og sammenligne frekvenserne af hver mutant mellem in vivo og in vitro biblioteker, betydningen af specifikke symbiont gener under bille kolonisering kan forudsiges.
Burkholderia gladioli kan engagere sig i en symbiotisk tilknytning til Lagria villosa biller, der spiller en vigtig rolle i forsvaret mod mikrobielle antagonister af insektværten4,5,6. Kvindelige biller huser flere stammer af B. gladioli i specialiseret kirtler tilbehør til det reproduktive system. Ved æglægning smører hunnerne B. gladioli-celler på ægoverfladen, hvor antimikrobielle forbindelser produceret af B. gladioli hæmmer infektioner ved entomopatogene svampe4,6. Under sen embryonal udvikling eller tidligt efter larverne luge koloniserer bakterierne cuticular invaginationer på larvernes dorsale overflade. På trods af denne specialiserede lokaliserings- og vertikale transmissionsrute for symbionterne kan L. villosa formentlig også erhverve B. gladioli vandret fra miljøet4. Desuden er mindst tre stammer af B. gladioli blevet fundet i samarbejde med L. villosa4,6. Blandt disse er B. gladioli Lv-StA den eneste, der er modtagelig for dyrkning in vitro.
B. gladioli Lv-StA har et genomstørrelse på 8,56 Mb6 og indeholder 7.468 gener. Hvilke af disse gener er vigtige for B. gladioli bakterier at kolonisere bille vært? For at besvare dette spørgsmål brugte vi transposon-indsættelse sekventering (Tn-seq), en udforskende metode til at identificere betinget væsentlige mikrobielle gener1,2,3. Et mutant bibliotek af B. gladioli Lv-StA blev oprettet ved hjælp af en Tn5 transposon. Gennem bøjning fra Escherichia coli donorceller til B. gladioli Lv-StA, en pRL27 plasmid transporterer Tn5 transposon og en antibiotikaresistens kassette flankeret af omvendte gentagelser blev overført (figur 1). Derved blev der genereret et sæt mutanter, der individuelt bærer forstyrrelser af 3.736 symbiontgener (Figur 2).
Den mutante pool blev inficeret på billeæg for at identificere koloniseringsfaktorerne og blev som kontrol også dyrket in vitro i King’s B (KB) medium. Efter at have givet tilstrækkelig tid til kolonisering blev udklækkede larver indsamlet og samlet til DNA-ekstraktion. Dna-fragmenter, der indeholder transposonindsatsen og den flankerende genomiske region B. gladioli Lv-StA, blev udvalgt ved hjælp af en modificeret DNA-biblioteksforberedelsesprotokol til sekventering. Læs kvalitetsbehandling efterfulgt af analyse med DESeq2 blev udført for at identificere specifikke gener, der er afgørende for B. gladioli Lv-StA for at kolonisere L. villosa larver, når de overføres via ægoverfladen.
En B. gladioli transposon mutant bibliotek blev genereret for at identificere vigtige værts kolonisering faktorer i symbiotiske samspil mellem L. villosa biller og B. gladioli bakterier. De vigtigste skridt i protokollen var bøjning, host-infektion, DNA-bibliotek forberedelse, og sekventering.
Da mange stammer af Burkholderia er modtagelige for genetisk modifikation vedbøjning 24,25, plasmid transporterer transposon og antibiotika indsættelse kassette blev konjugeret med succes i målet B. gladioli Lv-StA stamme fra E. coli. Tidligere forsøg på transformation ved elektroporation gav meget lav til næsten ingen B. gladioli transformanter. Det er tilrådeligt at optimere transformationsteknikken for målorganismen til effektivt at give et stort antal transformanter.
En runde af bøjning og 40 bøjning pletter forstyrret 3.736 gener i B. gladioli Lv-StA. Set i bakspejlet, flere runder af bøjning ville være nødvendigt at forstyrre de fleste af de 7.468 gener og få et mættet bibliotek. Især inkubationstiden under bøjningen fik ikke lov til at overstige 12-18 timer, hvilket er afslutningen på den eksponentielle vækstfase af B. gladioli. Hvis du tillader bøjning ud over den eksponentielle vækstfase af bakterieceller reducerer chancerne for succes for at opnå transkonjuganter26. Derfor bør bøjningsperioden justeres i henhold til bakterieartens vækst.
For at kunne udføre et eksperiment, der involverer infektion af mutant biblioteker i en vært, er det vigtigt at vurdere den bakterielle befolkning flaskehals størrelse under kolonisering og mangfoldigheden af mutanter i biblioteket før infektion1,2,27. Som forberedelse til eksperimentet anslog vi det mindste antal biller, der skal inficeret, for at have en stor chance for, at hver mutant i biblioteket prøves og får lov til at kolonisere. Den omtrentlige in vivo bakterieproduktionstid og antallet af generationer for eksperimentets varighed blev også beregnet. In vitro-kulturen blev derefter vokset op til et sammenligneligt antal generationer ved at justere inkubationstiden. For et lignende infektionseksperiment hos andre ikke-modelværter er evnen til at opretholde en laboratoriekultur og en konstant kilde til værtsorganismerne ønskelig.
Efter væksten af det mutante bibliotek in vivo og in vitro og prøvesamling blev der udført en modificeret DNA-biblioteksforberedelsesprotokol til transposon indsættelsessekvensering. Ændringen i protokollen involverede design af brugerdefinerede PCR-primere og tilføjelse af PCR-trin for at vælge dna-fragmenter, der indeholder indsætningskassetten. Da protokollen blev tilpasset, øgede yderligere PCR-cyklusser i protokollen risikoen for overamplificering og opnåelse af hybridiserede adapterkortfragmenter i slutbibliotekerne. Derfor anbefales et sidste oprydningstrin (uden størrelsesvalg) efter de to PCR’er, da det hjælper med at fjerne disse fragmenter. Størrelsen fordeling af DNA-biblioteker var stadig bredere end forventet. En forøgelse af sekventeringsdybden gav imidlertid tilstrækkelige data, der blev filtreret under bioinformatikanalysen, hvilket gav tilfredsstillende resultater.
Som transposon-medieret mutagenese genererer tusindvis af tilfældige indsættelser i et enkelt eksperiment, er det muligt at generere et mættet bibliotek af mutanter, der indeholder alle undtagen de mutanter, hvor gener afgørende for bakterievækst er blevet forstyrret. Vi sandsynligvis ikke arbejde med en mættet mutant bibliotek, i betragtning af skøn over væsentlige gener i andre undersøgelser på Burkholderia sp. 28,29. Et ikke-mættet bibliotek hjælper ikke desto mindre med at udforske forskellige kandidatgener til yderligere undersøgelser ved hjælp af målrettet mutagenese. Før forsøgene er det også vigtigt at huske, at nogle transposoner har specifikke indsætningsmålsteder, der øger overfloden af mutanter på visse loci i genomet30. Mariner transposoner er kendt for at målrette AT steder for indsættelse31, og Tn5 transposons har en GC bias32,33. Herunder trin under bioinformatik analyse til at genkende hotspots for transposon indsættelser vil hjælpe med at vurdere enhver fordeling bias.
Selvom tilbøjelige til tilbageslag, en veldesignet transposon indsættelse sekventering eksperiment kan være et kraftfuldt værktøj til at identificere mange betinget vigtige gener i bakterier inden for et enkelt eksperiment. For eksempel blev et dusin gener i Burkholderia seminalis vigtige for undertrykkelsen af orkidéblad nekrose identificeret ved at kombinere transposon mutagenese og genomforskning34. Ud over Burkholderia, flere vedhæftning og motilitet gener og transportører er blevet identificeret som vigtige kolonisering faktorer i Snodgrassella alvi symbionts af Apis mellifera (Honeybee)22, og i Vibrio fischerii symbionter af Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail blæksprutte)23 ved hjælp af transposon-indsættelse mutagenese tilgang.
Som en alternativ tilgang, transposon mutagenese kan efterfølges af screening for de enkelte mutanter ved hjælp af selektive medier i stedet for sekventering. Fænotypisk screening eller bioassays at identificere mangler, såsom motilitet, produktion af bioaktive sekundære metabolitter, eller specifikke auxotrophies, er mulige. For eksempel har screening af et Burkholderia insecticola (omfordelt til slægten Caballeronia35) transposon mutantbibliotek været nøglen til at identificere, at symbionterne anvender motilitetsgener til kolonisering af Riptortus pedestris, deres insektvært36. Desuden blev den biosynetiske genklynge til den bioaktive sekundære metabolitcaryoynencin identificeret i Burkholderia caryophylli37ved hjælp af transposon mutagenese og fænotypisk screening. En auxotrofisk mutant af Burkholderia pseudomallei blev identificeret efter transposon mutagenese og screening og er en mulig svækket vaccine kandidat mod melioidosis, en farlig sygdom hos mennesker og dyr38. Således transposon mutagenese og sekventering er en værdifuld tilgang til at studere de molekylære træk af bakterier, der er vigtige for samspillet med deres respektive værter i patogene eller mutualistiske foreninger.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Junbeom Lee for at give E. coli WM3064 + pRL27 stamme til bøjning og vejledning i proceduren, Kathrin Hüffmeier for at hjælpe med fejlfinding under mutant bibliotek generation, og Prof. André Rodrigues for at støtte insekt indsamling og tilladelse erhvervelse. Vi takker også Rebekka Janke og Dagmar Klebsch for støtte i indsamlingen og opdræt af insekterne. Vi anerkender de brasilianske myndigheder for at give følgende tilladelser til adgang, indsamling og eksport af insektprøver: SISBIO-godkendelse Nr. 45742-1, 45742-7 og 45742-10, CNPq-proces nº 01300.004320/2014-21 og 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF og 20BR035212/DF). Denne forskning blev støttet af midler fra German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 og KA2846/6-1.
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar – Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates – 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates – 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |