यह एक बर्कहोल्डरिया लाभकारी सहजीवी में उम्मीदवार कीट उपनिवेशीकरण कारकों की पहचान करने के लिए एक अनुकूलित तरीका है। बीटल होस्ट ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस के माध्यम से उत्पन्न एक यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय से संक्रमित है, और उपनिवेशीकरण के बाद पुस्तकालय जटिलता विट्रो मेंउगाए गए नियंत्रण की तुलना में होती है।
उनकी गतिविधि में हेरफेर करके जीन के कार्य का अनुमान लगाना अधिकांश जैविक प्रक्रियाओं के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए एक आवश्यक उपकरण है। आणविक माइक्रोबायोलॉजी में प्रगति ने जीन के हेरफेर के लिए विविध म्यूटेनेसिस तकनीकों का उद्भव देखा है। उनमें से, ट्रांसपोसन-सम्मिलन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) एक साथ कई उम्मीदवार जीन की कार्यक्षमता का एक अलक्षित तरीके से आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। यह तकनीक कई रोगजनक रोगाणुओं और कुछ लाभकारी सहजियों में यूकेरियोटिक मेजबानों के उपनिवेशीकरण के लिए आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण रही है।
यहां, टीएन-सेक्यू को बीटल लाग्रिया विल्लोसाके पारस्परिक बुर्कहोल्डरिया ग्लेडिओन्ट में उपनिवेशीकरण कारकों की पहचान करने के लिए एक विधि के रूप में स्थापित किया गया है। संयुग्मण द्वारा, टीएन5 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध कैसेट का सम्मिलन बी ग्लेडिओलीमें यादृच्छिक जीनोमिक स्थानों पर किया जाता है। बीटल होस्ट को उपनिवेश बनाने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता पर जीन अवरोधों के प्रभाव की पहचान करने के लिए, उत्पन्न बी ग्लेडिओली ट्रांसपोसन-उत्परिवर्ती पुस्तकालय बीटल अंडे पर टीका लगाया जाता है, जबकि एक तरल संस्कृति माध्यम में विट्रो में एक नियंत्रण उगाया जाता है। उपनिवेशीकरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के बाद, डीएनए वीवो और इन विट्रो विकसित पुस्तकालयों से निकाला जाता है। डीएनए लाइब्रेरी तैयार करने के प्रोटोकॉल के बाद, डीएनए नमूने ट्रांसपोसन-सम्मिलन अनुक्रमण के लिए तैयार किए जाते हैं। डीएनए के टुकड़े जिनमें ट्रांसपोसन-डालने वाले किनारे और फ्लैंकिंग बैक्टीरियल डीएनए होते हैं, का चयन किया जाता है, और उत्परिवर्तन साइटों को ट्रांसपोसन-डालने के किनारे से दूर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जाता है। अंत में, वीवो और इन विट्रो पुस्तकालयों के बीच प्रत्येक उत्परिवर्ती की आवृत्तियों का विश्लेषण और तुलना करके, बीटल उपनिवेशीकरण के दौरान विशिष्ट सहजीवी जीन के महत्व की भविष्यवाणी की जा सकती है।
बर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली लेग्रिया विलोसा बीटल के साथ एक सहजीवी संबंध में संलग्न हो सकता है, जोकीट मेजबान4,5, 6के माइक्रोबियल विरोधी के खिलाफ रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है। मादा बीटल प्रजनन प्रणाली के सहायक विशेष ग्रंथियों में बी ग्लेडिओली के कई उपभेदों को घर करती है। अंडे बिछाने पर, मादाएं अंडे की सतह पर बी ग्लेडिओली कोशिकाओं को धुंधला करती हैं जहां बी ग्लेडिओली द्वारा उत्पादित एंटीमाइक्रोबियल यौगिक एंटोमोपैथिक कवक4, 6द्वारा संक्रमण कोरोकतेहैं। देर से भ्रूणीय विकास के दौरान या लार्वा हैच के तुरंत बाद, बैक्टीरिया लार्वा की पृष्ठीय सतह पर क्यूटिकुलर इनवेजिनेशन को उपनिवेश करते हैं। इस विशेष स्थानीयकरण और सहजियों के ऊर्ध्वाधर पारेषण मार्ग के बावजूद, एल विल्लोसा संभवतः पर्यावरण4से बी ग्लेडिओली क्षैतिज रूप से भी प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, एल विल्लिसा4, 6के सहयोग से बी ग्लेडिओली के कम से कम तीन उपभेद पाए गएहैं। इनमें से बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए ही विट्रो मेंखेती करने योग्य है ।
बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए का जीनोम आकार 8.56 एमबी6 है और इसमें 7,468 जीन हैं। इनमें से कौन सा जीन बी ग्लेडिओली बैक्टीरिया के लिए बीटल होस्ट को उपनिवेश बनाने के लिए महत्वपूर्ण है? इस सवाल का जवाब देने के लिए, हमने ट्रांसपोसन-सम्मिलन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) का उपयोग किया, जो सशर्त आवश्यक माइक्रोबियल जीन1,2,3की पहचान करने के लिए एक अन्वेषणात्मक विधि है। बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए की एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय एक Tn5 ट्रांसपोसन का उपयोग करके बनाया गया था। एशेरिचिया कोलाई दाता कोशिकाओं से बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए तक, टीएन5 ट्रांसपोसन और उल्टे दोहराता द्वारा फ्लैंक किए गए एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट को ले जाने वाला एक pRL27 प्लाज्मिड स्थानांतरित कर दिया गया था(चित्र 1)। इस प्रकार, म्यूटेंट का एक सेट जो व्यक्तिगत रूप से 3,736 सहजीवी जीन के अवरोधों को ले जाता है(चित्र 2)उत्पन्न हुआ था।
उत्परिवर्ती पूल उपनिवेशन कारकों की पहचान करने के लिए बीटल अंडे पर संक्रमित था और, एक नियंत्रण के रूप में, राजा के बी (केबी) माध्यम में विट्रो में भी उगाया गया था। उपनिवेशीकरण के लिए पर्याप्त समय देने के बाद, रची लार्वा एकत्र किए गए और डीएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किए गए। ट्रांसपोसन डालने युक्त डीएनए के टुकड़े और बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए के पार्श्व जीनोमिक क्षेत्र अनुक्रमण के लिए एक संशोधित डीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग करके चुना गया था । पढ़ें गुणवत्ता प्रसंस्करण DESeq2 के साथ विश्लेषण के बाद बी ग्लेडिओली एलवी-StA के लिए महत्वपूर्ण विशिष्ट जीन की पहचान करने के लिए एल villosa लार्वा उपनिवेश जब अंडे की सतह के माध्यम से प्रेषित किया गया था ।
एल विल्लोसा बीटल और बी ग्लेडिओली बैक्टीरिया के बीच सहजीवी बातचीत में महत्वपूर्ण मेजबान उपनिवेशीकरण कारकों की पहचान करने के लिए एक बी ग्लेडिओली ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय उत्पन्न किया गया था। प्रोटोकॉल में प्रमुख कदम संाधीनता, मेजबान-संक्रमण, डीएनए पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण थे।
बर्कहोल्डरिया के कई उपभेदों को24,25को संयुग्मन द्वारा आनुवंशिक संशोधन के लिए उत्तरदायी है, ट्रांसपोसन और एंटीबायोटिक प्रविष्टि कैसेट को ले जाने वाले प्लाज्मिड को ई कोलाईसे लक्ष्य बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए तनाव में सफलतापूर्वक संयोजित किया गया था। इलेक्ट्रोपाउशन द्वारा परिवर्तन के पिछले प्रयासों में लगभग बी ग्लेडिओली ट्रांसफॉर्मेंट बहुत कम नहीं हुआ। लक्ष्य जीव के लिए परिवर्तन तकनीक को कुशलतापूर्वक बड़ी संख्या में ट्रांसफॉर्मेंट प्राप्त करने के लिए अनुकूलित करने की सलाह दी जाती है।
संयोजिका और ४० संविलियन स्पॉट के एक दौर ने बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए में ३,७३६ जीन को बाधित किया । मसा में, ७,४६८ जीन के अधिकांश को बाधित करने और एक संतृप्त पुस्तकालय प्राप्त करने के लिए conjugation के कई दौर आवश्यक होगा । विशेष रूप से, संविधि के दौरान इनक्यूबेशन समय को 12-18 घंटे से अधिक की अनुमति नहीं थी, जो बी ग्लेडिओलीके घातीय विकास चरण का अंत है। जीवाणु कोशिकाओं के घातीय विकास चरण से परे संयोजित करने की अनुमति देने से ट्रांसकोंजुगैंट26प्राप्त करने में सफलता की संभावना कम हो जाती है । इसलिए, संजीदब अवधि को बैक्टीरियल प्रजातियों के विकास के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
एक मेजबान में उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के संक्रमण से जुड़े एक प्रयोग को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए, उपनिवेशीकरण के दौरान बैक्टीरियल जनसंख्या अड़चनआकार और संक्रमण1,2, 27से पहले पुस्तकालय में म्यूटेंट की विविधता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। प्रयोग की तैयारी में, हमने बीटल की न्यूनतम संख्या का अनुमान लगाया है जिसे उच्च संभावना के लिए संक्रमित किया जाना चाहिए कि पुस्तकालय में प्रत्येक उत्परिवर्ती का नमूना लिया जाता है और उपनिवेश बनाने की अनुमति दी जाती है। वीवो बैक्टीरियल जनरेशन समय में अनुमानित और प्रयोग की अवधि के लिए पीढ़ियों की संख्या की भी गणना की गई थी। इसके बाद इन विट्रो कल्चर को इनक्यूबेशन बार एडजस्ट करके पीढ़ियों की तुलनात्मक संख्या में बड़ा हो गया । अन्य गैर-मॉडल मेजबानों में इसी तरह के संक्रमण प्रयोग के लिए, प्रयोगशाला संस्कृति और मेजबान जीवों के निरंतर स्रोत को बनाए रखने की क्षमता वांछनीय है।
वीवो और इन विट्रो और नमूना संग्रह में उत्परिवर्ती पुस्तकालय के विकास के बाद, ट्रांसपोसन प्रविष्टि अनुक्रमण के लिए एक संशोधित डीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल किया गया था। प्रोटोकॉल में संशोधन कस्टम पीसीआर प्राइमर डिजाइन और सम्मिलन कैसेट युक्त डीएनए टुकड़ों के लिए चयन करने के लिए पीसीआर कदम जोड़ने शामिल थे । क्योंकि प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था, प्रोटोकॉल में अतिरिक्त पीसीआर चक्रों ने ओवरएम्पलिफिकेशन का जोखिम बढ़ा दिया और अंत पुस्तकालयों में हाइब्रिड एडाप्टर-एडाप्टर टुकड़े प्राप्त किए। इसलिए, दो पीसीआर की सिफारिश के बाद एक अंतिम सफाई कदम (आकार चयन के बिना) की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह इन टुकड़ों को हटाने में मदद करता है। डीएनए पुस्तकालयों का आकार वितरण अभी भी उम्मीद से व्यापक था । हालांकि, अनुक्रमण गहराई बढ़ाने से पर्याप्त डेटा प्रदान किया गया जो जैव सूचना विश्लेषण के दौरान फ़िल्टर किए गए थे, संतोषजनक परिणाम प्राप्त करते थे।
चूंकि ट्रांसपोसन-मध्यस्थता वाले म्यूटेनेसिस एक ही प्रयोग में हजारों यादृच्छिक सम्मिलन उत्पन्न करता है, इसलिए म्यूटेंट की संतृप्त पुस्तकालय उत्पन्न करना संभव है जिसमें उन म्यूटेंट को छोड़कर सभी शामिल हैं जहां जीवाणु विकास के लिए आवश्यक जीन बाधित किए गए हैं। हम सबसे अधिक संभावना एक संतृप्त उत्परिवर्ती पुस्तकालय के साथ काम नहीं किया, Burkholderia सपा पर अंय अध्ययनों में आवश्यक जीन के अनुमानों को देखते हुए । 28,29. एक गैर संतृप्त पुस्तकालय फिर भी लक्षित म्यूटाजेनिसिस का उपयोग करके आगे के अध्ययनों के लिए विभिन्न उम्मीदवार जीन की खोज करने में मदद करता है। प्रयोगों से पहले, यह याद रखना भी महत्वपूर्ण है कि कुछ ट्रांसपोसंस में विशिष्ट सम्मिलन लक्ष्य साइटें हैं जो जीनोम30में कुछ लोकी पर म्यूटेंट की बहुतायत को बढ़ाती हैं। मेरिनर ट्रांसपोसंस को 31 और टीएन5 ट्रांसपोसंस में जीसी पूर्वाग्रह 32,33के लिए एटी साइटों को लक्षित करने के लिए जानाजाताहै। ट्रांसपोसन सम्मिलन के लिए हॉटस्पॉट को पहचानने के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण के दौरान कदम शामिल करने से किसी भी वितरण पूर्वाग्रह का आकलन करने में मदद मिलेगी।
हालांकि असफलताओं के लिए प्रवण, एक अच्छी तरह से डिजाइन ट्रांसपोसन प्रविष्टि अनुक्रमण प्रयोग एक ही प्रयोग के भीतर बैक्टीरिया में कई सशर्त महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है । उदाहरण के लिए, आर्किड लीफ नेक्रोसिस के दमन के लिए महत्वपूर्ण बर्कहोल्डरिया सेमिनालिस में एक दर्जन जीनों की पहचान ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और जीनोमिक्स34के संयोजन से की गई थी। बर्कहोल्डरियासे परे, कई आसंजन और गतिशीलता जीन और ट्रांसपोर्टरों को एपिस मेलिफेरा (मधुमक्खी) 22के स्नूडग्रासेला अल्वी सिंबियोन्ट्स में महत्वपूर्ण उपनिवेशीकरण कारकों के रूप में पहचाना गया है, और यूप्रिमना स्कोलोप्स (हवाई बॉबटेल स्क्विप्ड)23 में ट्रांसपोसन-सम्मिलन म्यूटेनेज़िस दृष्टिकोण का उपयोग करके विब्रियो फिशरी सिम्बाइवोट्स में।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस को अनुक्रमण के बजाय चयनात्मक मीडिया का उपयोग करके व्यक्तिगत म्यूटेंट के लिए स्क्रीनिंग के बाद किया जा सकता है। फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग या बायोएसाइड्स में कमियों की पहचान करने के लिए कहा गया है, जैसे कि गतिशीलता, बायोएक्टिव सेकेंडरी मेटाबोलाइट्स का उत्पादन, या विशिष्ट ऑक्सोट्रोफियों, संभव हैं। उदाहरण के लिए, एक बुर्केटेरिया कीटनाशक (जीनस Caballeronia35)ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय को पुनः असाइन की स्क्रीनिंग की पहचान करने में महत्वपूर्ण है कि सहजियों का उपनिवेश रिप्टोरटस पेडेस्ट्रिस,उनके कीट मेजबान36के लिए गतिशीलता जीन को नियोजित करते हैं। इसके अलावा, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग का उपयोग करके, बायोएक्टिव माध्यमिक मेटाबोलाइट कारियोयनेन्सिन के लिए बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर की पहचान बर्कहोल्डेरिया कारियोफिली37में की गई थी। बर्कहोल्डरिया छद्ममलेई के एक ऑक्सोट्रोफिक उत्परिवर्ती की पहचान ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और स्क्रीनिंग के बाद की गई थी और यह मेलिओइडोसिस के खिलाफ एक संभावित क्षीण टीका उम्मीदवार है, जो मनुष्यों और जानवरों में एक खतरनाक बीमारीहै। इस प्रकार, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और अनुक्रमण बैक्टीरिया के आणविक लक्षणों का अध्ययन करने में एक मूल्यवान दृष्टिकोण है जो रोगजनक या पारस्परिक संघों में अपने संबंधित मेजबानों के साथ बातचीत के लिए महत्वपूर्ण हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रक्रिया में conjugation और मार्गदर्शन के लिए ई. कोलाई WM3064 + pRL27 तनाव प्रदान करने के लिए जंबेम ली के आभारी हैं, उत्परिवर्ती पुस्तकालय उत्पादन के दौरान समस्या निवारण के साथ मदद करने के लिए कैथरिन Hüffmeier, और कीट संग्रह और परमिट अधिग्रहण का समर्थन करने के लिए प्रो आंद्रे रॉड्रिग्स । हम कीड़ों के संग्रह और पालन में समर्थन के लिए रिबेका जानकी और डैगमार क्लेबश को भी धन्यवाद देते हैं। हम कीट नमूनों के उपयोग, संग्रह और निर्यात के लिए निम्नलिखित परमिट प्रदान करने के लिए ब्राजील के अधिकारियों को स्वीकार करते हैं: SISBIO प्राधिकरण एनआर 45742-1, 45742-7 और 45742-10, सीएनपीक्यू प्रक्रिया nº 01300.004320/2014-21 और 01300.0013848/2017-33, IBAMA एनआर 14BR016151DF और 20BR035212/DF) । इस शोध को जर्मन साइंस फाउंडेशन (डीएफजी) रिसर्च ग्रांट FL1051/1-1 और KA2846/6-1 से फंडिंग ने सपोर्ट किया ।
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar – Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates – 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates – 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |