Dette er en tilpasset metode for å identifisere kandidatens insektkoloniseringsfaktorer i en Burkholderia gunstig symbiont. Billeverten er infisert med et tilfeldig mutantbibliotek generert via transposonmutagenese, og bibliotekets kompleksitet etter kolonisering sammenlignes med en kontroll dyrket in vitro.
Å utlede geners funksjon ved å manipulere deres aktivitet er et viktig verktøy for å forstå de genetiske understøttelsene av de fleste biologiske prosesser. Fremskritt innen molekylær mikrobiologi har sett fremveksten av ulike mutageneseteknikker for manipulering av gener. Blant dem er transposon-innsetting sekvensering (Tn-seq) et verdifullt verktøy for samtidig å vurdere funksjonaliteten til mange kandidatgener på en umålt måte. Teknikken har vært nøkkelen til å identifisere molekylære mekanismer for kolonisering av eukaryote verter i flere patogene mikrober og noen få gunstige symbionter.
Her er Tn-seq etablert som en metode for å identifisere koloniseringsfaktorer i en gjensidig Burkholderia gladioli symbiont av boblen Lagria villosa. Ved konjugering utføres Tn5 transposonmediert innsetting av en antibiotikaresistenskassett på tilfeldige genomiske steder i B. gladioli. For å identifisere effekten av genforstyrrelser på bakterienes evne til å kolonisere billeverten, blir det genererte B. gladioli transposonmutantbiblioteket inokulert på billeeggene, mens en kontroll vokser in vitro i et flytende kulturmedium. Etter å ha tillatt tilstrekkelig tid til kolonisering, blir DNA hentet fra in vivo og in vitro dyrkede biblioteker. Etter en DNA-biblioteksforberedelsesprotokoll er DNA-prøvene forberedt for sekvensering av transposoninnsetting. DNA-fragmenter som inneholder transposon-innsatskanten og flankebakterielle DNA velges, og mutasjonsstedene bestemmes ved å sekvensere bort fra transposon-innsatskanten. Til slutt, ved å analysere og sammenligne frekvensene til hver mutant mellom in vivo- og in vitro-bibliotekene, kan viktigheten av spesifikke symbiontgener under billekolonisering forutsies.
Burkholderia gladioli kan engasjere seg i en symbiotisk tilknytning til Lagria villosa beetles, spiller en viktig rolle i forsvar mot mikrobielle antagonister av insektverten4,5,6. Kvinnelige biller huser flere stammer av B. gladioli i spesialisert kjertler tilbehør til reproduktive systemet. Ved egglegging smører kvinner B. gladioliceller på eggoverflaten der antimikrobielle forbindelser produsert av B. gladioli hemmer infeksjoner ved entomopathogene sopp4,6. Under sen embryonal utvikling eller tidlig etter at larvene klekkes, koloniserer bakteriene kutikulære invaginasjoner på larvens dorsale overflate. Til tross for denne spesialiserte lokaliserings- og vertikale overføringsruten til symbiontene, kan L. villosa antagelig også skaffe seg B. gladioli horisontalt fra miljøet4. Videre er det funnet minst tre stammer av B. gladioli i forbindelse med L. villosa4,6. Blant disse er B. gladioli Lv-StA den eneste som er egnet til dyrking in vitro.
B. gladioli Lv-StA har en genomstørrelse på 8,56 Mb6 og inneholder 7468 gener. Hvilke av disse genene er viktige for B. gladiolibakterier for å kolonisere billeverten? For å svare på dette spørsmålet brukte vi sekvensering av transposoninnsetting (Tn-seq), en utforskende metode for å identifisere betinget essensielle mikrobielle gener1,2,3. Et mutantbibliotek av B. gladioli Lv-StA ble opprettet ved hjelp av en Tn5 transposon. Gjennom konjugering fra Escherichia coli donorceller til B. gladioli Lv-StA ble en pRL27-plasmid som bærer Tn5-transposonen og en antibiotikaresistenskassett flankert av inverterte repetisjoner overført (figur 1). Dermed ble det generert et sett med mutanter som individuelt bærer forstyrrelser av 3736 symbiontgener (figur 2).
Mutantbassenget ble smittet på billeegg for å identifisere koloniseringsfaktorene, og som en kontroll ble det også dyrket in vitro i King’s B (KB) medium. Etter å ha tillatt tilstrekkelig tid til kolonisering, ble klekkede larver samlet og samlet for DNA-ekstraksjon. Fragmenter av DNA som inneholder transposoninnsatsen og den flankende genomiske regionen B. gladioli Lv-StA ble valgt ved hjelp av en modifisert DNA-bibliotekforberedelsesprotokoll for sekvensering. Les kvalitetsbehandling etterfulgt av analyse med DESeq2 ble utført for å identifisere spesifikke gener som er avgjørende for B. gladioli Lv-StA for å kolonisere L. villosa larver når de overføres via eggoverflaten.
Et B. gladioli transposon mutantbibliotek ble generert for å identifisere viktige vertskoloniseringsfaktorer i det symbiotiske samspillet mellom L. villosa beetles og B. gladioli bakterier. De viktigste trinnene i protokollen var konjugering, vertsinfeksjon, DNA-bibliotekforberedelse og sekvensering.
Så mange stammer av Burkholderia er egnet til genetisk modifikasjon ved konjugering24,25, plasmid bærer transposon og antibiotika innsetting kassetter ble konjugert vellykket inn i målet B. gladioli Lv-StA stamme fra E. coli. Tidligere forsøk på transformasjon ved elektroporasjon ga svært lav til nesten ingen B. gladioli transformanter. Det anbefales å optimalisere transformasjonsteknikken for målorganismen for effektivt å gi et stort antall transformanter.
En runde med konjugering og 40 konjugeringsflekker forstyrret 3736 gener i B. gladioli Lv-StA. I ettertid vil flere runder med konjugering være nødvendig for å forstyrre de fleste av de 7468 genene og få et mettet bibliotek. Spesielt var inkubasjonstiden under konjugering ikke tillatt å overstige 12-18 timer, som er slutten på den eksponentielle vekstfasen av B. gladioli. Å tillate konjugering utover den eksponentielle vekstfasen av bakterieceller reduserer sjansene for suksess for å oppnå transkonjugerendemidler 26. Derfor bør konjugeringsperioden justeres i henhold til veksten av bakteriearter.
For å kunne utføre et eksperiment som involverer infeksjon av mutantbiblioteker i en vert, er det viktig å vurdere bakteriell populasjonsflaskehalsstørrelse under kolonisering og mangfoldet av mutanter i biblioteket før infeksjon1,2,27. Som forberedelse til eksperimentet estimerte vi det minste antall biller som må være smittet for å ha stor sjanse for at hver mutant i biblioteket blir samplet og tillatt å kolonisere. Den omtrentlige in vivo bakterielle generasjonstiden og antall generasjoner i løpet av eksperimentet ble også beregnet. In vitrokulturen ble deretter vokst opp til et sammenlignbart antall generasjoner ved å justere inkubasjonstiden. For et lignende infeksjonseksperiment i andre ikke-modellverter er evnen til å opprettholde en laboratoriekultur og en konstant kilde til vertsorganismer ønskelig.
Etter veksten av mutantbiblioteket in vivo og in vitro og prøvesamling, ble det utført en modifisert DNA-bibliotekforberedelsesprotokoll for transposoninnsettingssekvensering. Modifikasjonen i protokollen innebar å designe tilpassede PCR-primere og legge til PCR-trinn for å velge for DNA-fragmenter som inneholder innsettingskassett. Fordi protokollen ble tilpasset, økte flere PCR-sykluser i protokollen risikoen for overamplifisering og henting av hybridiserte kortkortfragmenter i sluttbibliotekene. Derfor anbefales et siste oppryddingstrinn (uten størrelsesvalg) etter at de to PCR-ene er anbefalt, da det hjelper med å fjerne disse fragmentene. Størrelsesfordelingen til DNA-bibliotekene var fortsatt bredere enn forventet. Økt sekvenseringsdybde ga imidlertid tilstrekkelige data som ble filtrert under bioinformatikkanalyse, og fikk tilfredsstillende resultater.
Ettersom transposonmediert mutagenese genererer tusenvis av tilfeldige innsettinger i et enkelt eksperiment, er det mulig å generere et mettet bibliotek med mutanter som inneholder alle unntatt de mutantene der gener som er avgjørende for bakterievekst har blitt forstyrret. Vi jobbet mest sannsynlig ikke med et mettet mutantbibliotek, gitt beregninger av essensielle gener i andre studier på Burkholderia sp. 28,29. Et ikke-mettet bibliotek hjelper likevel med å utforske ulike kandidatgener for videre studier ved hjelp av målrettet mutagenese. Før forsøkene er det også viktig å huske at noen transposoner har spesifikke innsettingsmålsteder som øker overflod av mutanter på visse loci i genomet30. Mariner-transposoner er kjent for å være rettet mot AT-områder for innsettingav 31, og Tn5-transposoner har en GC-bias32,33. Inkludert trinn under bioinformatikkanalyse for å gjenkjenne hotspots for transposoninnsettinger vil bidra til å vurdere eventuelle distribusjonsbias.
Selv om det er utsatt for tilbakeslag, kan et godt designet sekvenseringseksperiment for transposoninnsetting være et kraftig verktøy for å identifisere mange betinget viktige gener i bakterier i et enkelt eksperiment. For eksempel ble et dusin gener i Burkholderia seminalis viktig for undertrykkelse av orkidébladnekrose identifisert ved å kombinere transposonmutagenese og genomikk34. Utover Burkholderiahar flere adhesjons- og motilitetsgener og transportører blitt identifisert som viktige koloniseringsfaktorer i Snodgrassella alvi symbionter av Apis mellifera (Honeybee)22, og i Vibrio fischerii symbionter av Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail blekksprut)23 ved hjelp av transposon-innsetting mutagenesis tilnærming.
Som en alternativ tilnærming kan transposonmutagenese etterfølges av screening for individuelle mutanter som bruker selektive medier i stedet for sekvensering. Fenotypisk screening eller bioassays for å identifisere mangler, for eksempel motilitet, produksjon av bioaktive sekundære metabolitter, eller spesifikke auxotrofier, er gjennomførbare. For eksempel har screening av en Burkholderia insekticola (omplassert til slekten Caballeronia35) transposon mutantbibliotek vært nøkkelen til å identifisere at symbiontene bruker motilitetsgener for kolonisering av Riptortus pedestris, deres insektvert36. Videre, ved hjelp av transposonmutagenese og fenotypisk screening, ble den biosyntetiske genklyngen for den bioaktive sekundære metabolittkaryoynencin identifisert i Burkholderia caryophylli37. En auxotrofisk mutant av Burkholderia pseudomallei ble identifisert etter transposonmutagenese og screening og er en mulig svekket vaksinekandidat mot melioidose, en farlig sykdom hos mennesker og dyr38. Dermed er transposonmutagenese og sekvensering en verdifull tilnærming til å studere molekylære egenskaper av bakterier som er viktige for interaksjonene med sine respektive verter i patogene eller gjensidige foreninger.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Junbeom Lee for å ha levert E. coli WM3064+pRL27-stammen for konjugering og veiledning i prosedyren, Kathrin Hüffmeier for å hjelpe til med feilsøking under mutant bibliotekgenerering, og prof. André Rodrigues for å støtte insektinnsamling og tillatelsesanskaffelse. Vi takker også Rebekka Janke og Dagmar Klebsch for støtte i innsamling og oppdrett av insekter. Vi anerkjenner brasilianske myndigheter for å gi følgende tillatelser for tilgang, innsamling og eksport av insektprøver: SISBIO-autorisasjon Nr. 45742-1, 45742-7 og 45742-10, CNPq prosess nº 01300.004320/2014-21 og 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF og 200BR35212/DF). Denne forskningen ble støttet av midler fra German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 og KA2846/6-1.
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar – Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates – 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates – 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |