Detta är en anpassad metod för att identifiera kandidat insekt kolonisering faktorer i en Burkholderia fördelaktig symbiont. Skalbaggen värd är infekterad med ett slumpmässigt mutantbibliotek genereras via transposon mutagenes, och bibliotekets komplexitet efter kolonisering jämförs med en kontroll som odlas in vitro.
Att härleda genens funktion genom att manipulera deras aktivitet är ett viktigt verktyg för att förstå de genetiska grunderna för de flesta biologiska processer. Framsteg inom molekylär mikrobiologi har sett framväxten av olika mutagenestekniker för manipulering av gener. Bland dem är transposon-insättningssekvensering (Tn-seq) ett värdefullt verktyg för att samtidigt bedöma funktionaliteten hos många kandidatgener på ett obefläckat sätt. Tekniken har varit nyckeln till att identifiera molekylära mekanismer för kolonisering av eukaryota värdar i flera patogena mikrober och några fördelaktiga symbionter.
Här är Tn-seq etablerad som en metod för att identifiera koloniseringsfaktorer i en mutualistisk Burkholderia gladioli symbiont av skalbaggen Lagria villosa. Genom konjugation utförs Tn5 transposonmedierad insättning av en antibiotikaresistenskassett på slumpmässiga genomiska platser i B. gladioli. För att identifiera effekten av genstörningar på bakteriernas förmåga att kolonisera skalbaggens värd, vaccinerar det genererade B. gladioli transposon-mutantbiblioteket på skalbaggeäggen, medan en kontroll odlas in vitro i ett flytande odlingsmedium. Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för kolonisering extraheras DNA från in vivo- och in vitro-odlade bibliotek. Efter ett DNA-biblioteksprepareringsprotokoll förbereds DNA-proverna för transposoninsättningssekvensering. DNA-fragment som innehåller transposon-insert kanten och flankerande bakteriellt DNA väljs, och mutationsplatserna bestäms genom sekvensering bort från transposon-insert kanten. Slutligen, genom att analysera och jämföra frekvenserna för varje mutant mellan in vivo- och in vitro-biblioteken, kan vikten av specifika symbionta gener under skalbaggekoloniseringen förutsägas.
Burkholderia gladioli kan delta i en symbiotisk associering med Lagria villosabaggar, som spelar en viktig roll i försvaret mot mikrobiella antagonister hos insektsvärden4,5,6. Kvinnliga skalbaggar hus flera stammar av B. gladioli i specialiserade körtlar tillbehör till reproduktionssystemet. Vid äggläggning utstryker kvinnor B. gladioliceller på äggytan där antimikrobiella föreningar som produceras av B. gladioli hämmar infektioner av entomopathogenicsvampar 4,6. Under sen embryonal utveckling eller tidigt efter larvernas kläckning koloniserar bakterierna cuticular invaginations på larvernas dorsala yta. Trots denna specialiserade lokalisering och vertikala överföringsväg av symbionterna, kan L. villosa förmodligen också förvärva B. gladioli horisontellt från miljön4. Dessutom har minst tre stammar av B. gladioli hittats i samband med L. villosa4,6. Bland dessa är B. gladioli Lv-StA den enda som är mottaglig för odling in vitro.
B. gladioli (född 1977) Lv-StA har en genomstorlek på 8,56 Mb6 och innehåller 7 468 gener. Vilka av dessa gener är viktiga för B. gladioli bakterier att kolonisera skalbaggen värd? För att svara på denna fråga använde vi transposon-insättningssekvensering (Tn-seq), en explorativ metod för att identifiera villkorligt väsentliga mikrobiella gener1,2,3. Ett mutantt bibliotek av B. gladioli Lv-StA skapades med hjälp av en Tn5 transposon. Genom konjugation från Escherichia coli donatorceller till B. gladioli Lv-StA överfördes en pRL27 plasmid som bär Tn5 transposon och en antibiotikaresistenskassett flankerad av inverterade upprepningar (Figur 1). Därmed genererades en uppsättning mutanter som individuellt bär störningar av 3 736 symbionta gener (figur 2).
Mutantpoolen smittades på skalbaggeägg för att identifiera koloniseringsfaktorerna och odlades som en kontroll också in vitro i King’s B (KB) medium. Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för kolonisering samlades kläckta larver och poolades för DNA-extraktion. Fragment av DNA som innehåller transposoninsatsen och den flankerande genomiska regionen B. gladioli Lv-StA valdes med hjälp av ett modifierat DNA-biblioteksprepareringsprotokoll för sekvensering. Läskvalitetsbearbetning följt av analys med DESeq2 utfördes för att identifiera specifika gener som är avgörande för B. gladioli Lv-StA att kolonisera L. villosa larver när de överförs via äggytan.
Ett B. gladioli transposon mutant bibliotek genererades för att identifiera viktiga värd kolonisering faktorer i symbiotiska interaktionen mellan L. villosa skalbaggar och B. gladioli bakterier. De viktigaste stegen i protokollet var konjugation, värdinfektion, DNA-biblioteksförberedelse och sekvensering.
Eftersom många stammar av Burkholderia är mottagliga för genetisk modifiering genom konjugation24,25, plasmiden som bär transposon och antibiotikainsättningskassett konjugerades framgångsrikt i mål B. gladioli Lv-StA stam från E. coli. Tidigare försök till omvandling genom elektroporation gav mycket låg till nästan inga B. gladioli transformanter. Det är lämpligt att optimera omvandlingstekniken för målorganismen för att effektivt ge ett stort antal transformatorer.
En omgång konjugation och 40 konjugationsfläckar störde 3 736 gener i B. gladioli Lv-StA. Med facit i hand skulle flera konjugationsrundor vara nödvändiga för att störa de flesta av de 7 468 generna och få ett mättat bibliotek. Särskilt fick inkubationstiden under konjugation inte överstiga 12-18 h, vilket är slutet på den exponentiella tillväxtfasen av B. gladioli. Att tillåta konjugation bortom bakteriecellernas exponentiella tillväxtfas minskar chanserna att lyckas få transkonjuganter26. Därför bör konjugationsperioden justeras efter bakteriearternas tillväxt.
För att framgångsrikt utföra ett experiment som involverar infektion av mutantbibliotek i en värd är det viktigt att bedöma bakteriepopulationens flaskhalsstorlek under koloniseringen och mångfalden av mutanter i biblioteket före infektion1,2,27. Som förberedelse för experimentet uppskattade vi det minsta antalet skalbaggar som måste infekteras för att ha en hög chans att varje mutant i biblioteket provtas och får kolonisera. Den ungefärliga bakteriegenereringstiden in vivo och antalet generationer under experimentets varaktighet beräknades också. In vitro-kulturen växte sedan upp till ett jämförbart antal generationer genom att justera inkubationstiden. För ett liknande infektionsexperiment hos andra icke-modellvärdar är förmågan att upprätthålla en laboratoriekultur och en konstant källa till värdorganismerna önskvärd.
Efter tillväxten av mutanta biblioteket in vivo och in vitro och prov samling, genomfördes ett modifierat DNA bibliotek förberedelse protokoll för transposon insättning sekvensering. Ändringen i protokollet innebar att designa anpassade PCR-primers och lägga till PCR-steg för att välja för DNA-fragment som innehåller insättningskassetten. Eftersom protokollet har anpassats ökade ytterligare PCR-cykler i protokollet risken för överamplifiering och erhållande av hybridiserade nätverkskortsfragment i slutbiblioteken. Därför rekommenderas ett slutligt rensningssteg (utan storleksval) efter de två PCR: erna, eftersom det hjälper till att ta bort dessa fragment. Storleksfördelningen av DNA-biblioteken var fortfarande bredare än väntat. Att öka sekvenseringsdjupet gav dock tillräckliga data som filtrerades under bioinformatikanalysen, vilket gav tillfredsställande resultat.
Eftersom transposonmedierad mutagenes genererar tusentals slumpmässiga införanden i ett enda experiment är det möjligt att generera ett mättat bibliotek av mutanter som innehåller alla utom de mutanter där gener som är väsentliga för bakterietillväxt har störts. Vi fungerade troligen inte med ett mättat mutantbibliotek, med tanke på uppskattningarna av väsentliga gener i andra studier på Burkholderia sp. 28,29. Ett icke-mättat bibliotek hjälper ändå till att utforska olika kandidatgener för ytterligare studier med hjälp av riktad mutagenes. Före experimenten är det också viktigt att komma ihåg att vissa transposoner har specifika insättningsmålplatser som ökar överflödet av mutanter vid vissa lokus igenomet 30. Mariner transpoons är kända för att rikta in sig på AT-platser för insättning31, och Tn5 transposoner har en GC bias32,33. Att inkludera steg under bioinformatikanalys för att känna igen hotspots för transposoninfogningar hjälper till att bedöma eventuella distributionsfördomar.
Även om det är utsatt för bakslag kan ett väl utformat transposoninsättningssekvenseringsexperiment vara ett kraftfullt verktyg för att identifiera många villkorligt viktiga gener i bakterier inom ett enda experiment. Till exempel identifierades ett dussin gener i Burkholderia seminalis viktigt för undertryckandet av orkidéblad nekros genom att kombinera transposon mutagenes och genomik34. Bortom Burkholderiahar flera vidhäftnings- och motilitetsgener och transportörer identifierats som viktiga koloniseringsfaktorer i Snodgrassella alvi symbionter av Apis mellifera (Honeybee)22, och i Vibrio fischerii symbionts av Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail squid)23 med hjälp av transposon-insertion mutagenesis strategi.
Som ett alternativt tillvägagångssätt kan transposon mutagenesis följas av screening för enskilda mutanter med selektiva medier istället för sekvensering. Fenotypisk screening eller bioassays för att identifiera brister, såsom motility, produktion av bioaktiva sekundära metaboliter, eller specifika auxotrophies, är genomförbara. Till exempel har screening av en Burkholderia insecticola (omplacerad till släktet Caballeronia35) transposon mutantbibliotek varit nyckeln till att identifiera att symbionterna använder motilitetsgener för att kolonisera Riptortus piedestris, deras insekt värd36. Med hjälp av transposon mutagenes och fenotypisk screening identifierades dessutom det biosyntetiska genklustret för den bioaktiva sekundära metaboliten caryoynencin i Burkholderia caryophylli37. En auxotrophic mutant av Burkholderia pseudomallei identifierades efter transposon mutagenes och screening och är en möjlig försvagad vaccin kandidat mot melioidosis, en farlig sjukdom hos människor och djur38. Således är transposon mutagenes och sekvensering ett värdefullt tillvägagångssätt för att studera de molekylära egenskaperna hos bakterier som är viktiga för interaktionerna med sina respektive värdar i patogena eller mutualistiska associationer.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Junbeom Lee för att ha tillhandahållit E. coli WM3064 +pRL27-stammen för konjugation och vägledning i förfarandet, Kathrin Hüffmeier för att ha hjälpt till med felsökning under mutantbiblioteksgenerering och prof. André Rodrigues för att stödja insektsinsamling och tillståndsförvärv. Vi tackar också Rebekka Janke och Dagmar Klebsch för stödet vid insamling och uppfödning av insekterna. Vi bekräftar de brasilianska myndigheterna för att bevilja följande tillstånd för tillgång, insamling och export av insektsprover: SISBIO-tillstånd nr 45742-1, 45742-7 och 45742-10, CNPq process nº 01300.004320/2014-21 och 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF och 20BR035212/DF). Denna forskning stöddes av finansiering från German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 och KA2846/6-1.
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar – Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates – 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates – 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |