तीन आयामों में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी
Summary
प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM) का उपयोग प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विशिष्ट विवर्तन सीमा को बाईपास करने और नैनोमीटर पैमाने पर एक्सोसोम्स को देखने के लिए किया जाता है। यह एक्सोसोम्स की विशेषता के लिए दो और तीन दोनों आयामों में नियोजित किया जा सकता है।
Abstract
एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी सेल प्रकारों द्वारा जारी किए जाते हैं और सेल सिग्नलिंग और होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ईवीएस के दृश्य के लिए अक्सर उनके छोटे व्यास (40-250 एनएम) के कारण अप्रत्यक्ष तरीकों की आवश्यकता होती है, जो विशिष्ट प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा के नीचे है। हमने दो और तीन आयामों दोनों में विवर्तन सीमा को दरकिनार करने के लिए ईवीएस का एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी-आधारित दृश्य विकसित किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम जेड-एक्सिस के साथ XY-धुरी और +/-50 एनएम संकल्प पर +/-20 एनएम संकल्प के भीतर ईवीएस के त्रि-आयामी आकार को हल कर सकते हैं । अंत में, हम प्रस्ताव करते हैं कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को ईवीएस की लक्षण वर्णन विधि के रूप में माना जाए, जिसमें एक्सोसोम्स के साथ-साथ छा जाने वाले वायरस भी शामिल हैं।
Introduction
एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी सेल प्रकारों द्वारा जारी झिल्ली-बाध्य वेसिकल्स हैं। इनमें लिपिड, प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स और न्यूक्लिक एसिड होते हैं और इन सामग्रियों को स्थानीय रूप से कोशिकाओं के बीच और ऊतकों और अंगों के बीच डिस्टली स्थानांतरित करते हैं। ईवीएस के तीन प्राथमिक उपप्रकार हैं: एपोटोटिक निकाय, माइक्रोवेसिकल्स, और एक्सोसोम1,2। यहां, हम एक्सोसोम्स और उसके जुड़े प्रोटीन पर अपनी चर्चा केंद्रित करते हैं।
एक्सोसोम्स को मल्टीवेस्कुलर बॉडी (एमवीबी) में शुरुआती एंडोसोम्स के आवक नवोदित से निकलने वाले वेसिकल्स को स्रावित किया जाता है। एमवीबी तब प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ करता है, जो एक्सोसोम्स को अन्य कोशिकाओं3,4की यात्रा करने के लिए बाह्य अंतरिक्ष में जारी करता है। एक्सोसोम 40 से 150 एनएम तक के आकारों के स्पेक्ट्रम पर मौजूद होते हैं और एंडोसोमल ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन से समृद्ध होते हैं जिसे टेट्रास्पैनिन (सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81), परिवहन (ईएससीआरटी) के लिए आवश्यक झिल्ली-बाध्य एंडोसोमल छंटाई परिसर और लिपिड बेड़ा से जुड़े प्रोटीन1,2,5,6, 7के रूप में जानाजाताहै।
एक्सोसोम्स के बायोकेमिकल मेकअप की विशेषता शोधकर्ताओं के लिए उनके कार्यात्मक स्वभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है । नैनोस्केल फ्लो साइटोमेट्री, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए), स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएमई), सरफेस प्लाजन अनुनाद, प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग और पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी सहित एक्सोसोम्स की कल्पना और विशेषता के लिए कई विधियां मौजूद हैं, जिनमें से प्रत्येक में आंतरिक पेशेवरों और विपक्ष8,9शामिल हैं। TEM और क्रायो-ईएम नैनोमीटर आधारित संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन अक्सर निर्जलीकरण और फ्रीज-फ्रैक्चर चरणों की आवश्यकता होती है, जिससे ईवी10, 11सिकुड़ या lysing होता है। एनटीए प्रकाश बिखरने पर निर्भर करता है, जो एक समय में सैकड़ों ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, लेकिन कणों के आकार का एक अप्रत्यक्ष माप है और आसानी से ईवीएस, वायरस और प्रोटीन के बीच अंतर नहीं कर सकता है12,13, 14,15,16। नैनोस्केल प्रवाह साइटोमेट्री एक उत्तेजन पथ से प्रकाश बिखरने को नियोजित करता है, जिसे तब आकार माप में अनुवादित किया जा सकता है, लेकिन एक उभरती हुई तकनीक है, और विभिन्न उपकरणों12,17,18के लिए पता लगाने की रैखिक सीमा के भीतर कणों का आकार क्याहै,इस पर बहुत कम आम सहमति है।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों का उपयोग करके पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक कोशिका के भीतर उपकोशिकीय डिब्बों, प्रोटीन परिसरों और सिग्नलिंग मशीनरी की कल्पना करने के लिए सबसे भारी नियोजित तकनीकों में से एक रही है। हालांकि यह तकनीक परिसरों के स्थानीयकरण की कल्पना करने में उपयोगी साबित होती है, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी (लगभग 250-400 एनएम) की विवर्तन सीमा एक एक्सोसोम (40-150 एनएम)12,19,20की विशिष्ट आकार सीमा में प्रोटीन या संरचनाओं के स्पष्ट समाधान को रोकती है।
सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, अर्थात्, प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM), विशिष्ट फ्लोरोफोरस के फोटोस्विचेबल गुणों को नियोजित करके पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी से खुद को अलग करता है और नैनोमीटर सटीक21के नीचे छवियों को पुनर्निर्मित करने के लिए इन निमिष घटनाओं का पता लगाता है। फोटोस्विचिंग घटनाओं को दसियों हजार व्यक्तिगत एक्सपोजर के दौरान एक उच्च-फ्रेमरेट डिटेक्शन कैमरे का उपयोग करके एकत्र किया जाता है, और एक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन का उपयोगफोटोस्विचिंग फ्लोरोफोर19,20, 22के सटीक स्थान को उच्च आत्मविश्वास के साथ मैप करने के लिए कियाजाताहै। यह dstorm प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बाईपास करने की अनुमति देता है। कई समूहों ने एक्सोसोम्स और 22 ,23 , 24 , 25के विशेषज्ञों और 22,23 , 24,25को कल्पना करने और ट्रैक करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकोंकेउपयोग की सूचना दी है। अंतिम संकल्प फ्लोरोफोर के जैव भौतिक गुणों पर निर्भर करता है, लेकिन अक्सर XY-अक्ष के साथ +/-10-100 एनएम से लेकर होता है, जिससे एकल अणु संकल्प की अनुमति होती है ।
XY-धुरी पर इस पैमाने पर व्यक्तिगत फ्लोरोफोरस को हल करने की क्षमता ने माइक्रोस्कोपी में क्रांति ला दी है। हालांकि, एक एक्सोसोम के त्रि-आयामी (3-डी) dSTORM पर थोड़ा डेटा है। इसलिए, हमने 3-डी में नैनोमीटर परिशुद्धता के लिए एक्सोसोम सहित डीस्टॉर्म-आधारित विज़ुअलाइज़ेशन और शुद्ध ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया (एसओपी) स्थापित करने की मांग की।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईवीएस कई इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं और सेल-टू-सेल सिग्नलिंग1,30में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण अध्ययन का एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है। हालांकि, उनका विज़ुअलाइज़ेशन मुश्किल सा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऑक्सफोर्ड नैनोइमेजिंग को उनकी रचनात्मक प्रतिक्रिया और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस कार्य को 5UM1CA121947-10 से आर.पी. .M और 1R01DA040394 से डी.पी.डी.
Materials
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
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