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Biologia

3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법 (dSTORM)은 빛 현미경 검사법의 전형적인 회절 한계를 우회하고 나노 미터 척도에서 엑소좀을 보는 데 사용됩니다. 엑소좀을 특성화하기 위해 2차원과 3차원에서 모두 사용할 수 있다.

Abstract

세포 외 소포 (EV)는 모든 세포 유형에 의해 방출되고 세포 신호 및 항상성에 중요한 역할을합니다. 전기 EV의 시각화는 종종 일반적인 빛 현미경 검사법의 회절 한계 아래에있는 작은 직경 (40-250 nm)으로 인해 간접적인 방법이 필요합니다. 우리는 2 차원과 3 차원 모두에서 회절 제한을 우회하기 위해 전기 TV의 초해상도 현미경 기반 시각화를 개발했습니다. 이 방법을 사용하여 XY 축및 XY 축에서 +/- 20 nm 해상도 내에서 EV의 3차원 모양을 해결하고 Z축을 따라 50nm 해상도로 해결할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 초해상도 현미경 검사법이 외성뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스를 포함한 EV의 특성화 방법으로 간주될 것을 제안합니다.

Introduction

세포 외 소포 (EV)는 모든 세포 유형에 의해 방출되는 막 바인딩 소포입니다. 그(것)들은 지질, 단백질, 대사 산물 및 핵산을 포함하고 조직과 기관 사이 세포 사이 를 현지으로 이 물질을 전송합니다. 전기 의 세 가지 기본 하위 유형이 있다: apoptotic 바디, microvesicles, 및 엑소좀1,2. 여기에서, 우리는 엑소좀과 그들의 관련한 단백질에 우리의 토론을 집중합니다.

엑소좀은 초기 내종의 내후 신진에서 다중 혈관 체(MVB)로 유래한 소포를 분비한다. MVB는 그 때 플라즈마 막과 융합하여 외식을 세포외 공간으로 방출하여 다른세포3,4로이동한다. 엑소좀은 40~150nm에 이르는 다양한 크기의 스펙트럼에 존재하며 테트라스판닌(CD9, CD63, CD81), 수송에 필요한 막 경계 내도 선별 복합체(ESCRT), 지질 래프트 관련 단백질1,2,5,6,7로구성된 내피 반막 단백질로 풍부하게 함유되어 있다.

엑소좀의 생화학적 구성을 특징짓는 것은 연구자들이 기능성 특성을 더 잘 이해할 수 있는 인기 있는 분야가 되었습니다. 나노스케일 유동 세포측정, 나노입자 추적 분석(NTA), 스캐닝 및 투과 전자 현미경검사(TEM), 표면 플라스몬 공명, 저항 펄스 감지 및 전통적인 광 현미경 검사법을 포함한 엑소좀을 시각화하고 특성화하기 위한 많은 방법이 존재하며, 각각 내장된 프로및 단점8,9을함유하고 있다. TEM 및 저저온-EM은 나노미터 기반 해상도를 달성할 수 있지만 탈수 및 동결 골절 단계가 필요하므로 EV10,11을축소하거나 용해합니다. NTA는 빛 산란에 의존하여 한 번에 수백 대의 전기 Ev의 특성화를 허용하지만 입자 크기의 간접 측정이며 EV, 바이러스 및 단백질 집계12,13,14,15,16을쉽게 구별할 수 없다. 나노스케일 유동 세포측정은 난리 경로로부터 광산란을 사용하여 크기 측정으로 변환할 수 있지만 신흥 기술이며, 다양한계측기(12,17,18)에대한 검출의 선형 범위 내에 있는 입자의 크기에 대해서는 거의 합의가 없다.

형광 단백질 이나 염료를 사용 하 여 전통적인 빛 현미경 검사량 세포 구획을 시각화 하기 위한 가장 많이 사용 되는 기술 중 하나입니다., 단백질 복합체, 그리고 세포 내에서 신호 기계. 이 기술은 복합체의 국소화를 시각화하는 데 유용하지만, 전통적인 광 현미경 검사법(약 250-400 nm)의 회절 제한은 엑소좀(40-150 nm)12,19,20의일반적인 크기 범위에서 단백질 또는 구조의 명확한 분해를 방지한다.

초분해능 현미경 검사법, 즉 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법(dSTORM)은 특정 형광의 광전환 특성을 활용하고 이러한 깜박이는 이벤트를 감지하여 나노미터정밀도(21)로이미지를 재구성하여 기존의 광 현미경 검사법과 구별한다. 포토스위칭 이벤트는 수만 개의 개별 노출 과정에서 고액 검출 카메라를 사용하여 수집되며, 포인트 스프레드 기능은 포토스위칭형광(19,20,22)의정확한 위치를 높은 신뢰도로 매핑하는 데 사용된다. 이를 통해 DSTORM은 빛 현미경 검사법의 회절 한계를 우회할 수 있습니다. 몇몇 단은 엑소좀 및 그들의 관련 단백질을 시각화하고 추적하기 위한 초해상도 기술의 사용을 보고했습니다22,23,24,25. 최종 해상도는 형광의 생물학적 특성에 따라 다르지만 XY 축을 따라 +/-10-100 nm부터 다양하여 단일 분자 분해능을 허용합니다.

XY 축에서 이 척도에서 개별 형광을 해결하는 기능은 현미경 검사법에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 엑소좀의 3차원(3차원) dSTORM에 대한 데이터는 거의 없다. 따라서, 우리는 3-D에서 나노 미터 정밀도에 엑소좀을 포함하여 dSTORM 기반의 시각화 및 정제 된 전기 의 특성화를위한 표준 운영 절차 (SOP)를 확립하고자했습니다.

Protocol

1 세포주 전파 및 유지 보수 인간 골육종 세포 (U2OS)를 획득하고 10 % 엑소좀이없는 태아 소 혈청과 1 x 페니실린 / 연쇄 상미신 용액으로 보충 된 성장 배지에 세포를 배치합니다.참고 : 외성없는 태아 소 혈청은 McNamara 등에서 제시 된 프로토콜에 따라 생성되었습니다. al.26. T175 플라스크26,27에서5% CO2 및 통로 세?…

Representative Results

이 연구의 목적은 3차원(3차원)으로 나노미터 해상도로 개별 전기를 시각화하는 초해상도 현미경 검사법의 효과를 평가하는 것이었습니다. 개별 EV의 모양과 크기를 분석하기 위해 광전환 가능한 염료를 채택하고 극한빨간색, 막 교화 염료로 전기를 배양하고크로마토그래피(29)를통해 과잉 염료를 제거했습니다. 친화성 캡처 안티 CD81 및 적색 스테인드 전기는 640 nm 흥분 레이저에…

Discussion

전기자동차는 많은 세포내 프로세스 및 세포 간 신호1,30에서중요한 역할을 하기 때문에 연구의 인기 영역이 되었다. 그러나, 그들의 시각화는 그들의 작은 크기가 빛 현미경 검사법의 회절 한계 이하로 떨어지기 때문에 어려운 것으로 판명됩니다. 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법(dSTORM)은 시간이 지남에 따라 개별 형광의 광전환 이벤트를 캡처하?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 그들의 건설적인 피드백과 지도에 대한 옥스포드 나노 이미징에 감사드립니다. 이 작품은 5UM1CA121947-10에서 R.P.M및 1R01DA040394에서 D.P.D.에 의해 지원되었습니다.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
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Riferimenti

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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
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