Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) används för att kringgå den typiska diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi och för att visa exosomer på nanometerskalan. Det kan användas i både två och tre dimensioner för att karakterisera exosomer.
Extracellulära blåsor (EVs) frigörs av alla celltyper och spelar en viktig roll i cellsignalering och homeostas. Visualiseringen av EVs kräver ofta indirekta metoder på grund av deras lilla diameter (40-250 nm), vilket ligger under diffraktionsgränsen för typisk ljusmikroskopi. Vi har utvecklat en mikroskopibaserad visualisering av EL-apparater med superupplösning för att kringgå diffraktionsgränsen i både två och tre dimensioner. Med den här metoden kan vi lösa den tredimensionella formen av EVs till inom +/- 20 nm upplösning på XY-axeln och +/- 50 nm upplösning längs Z-axeln. Sammanfattningsvis föreslår vi att superupplösningsmikroskopi betraktas som en karakteriseringsmetod för EVs, inklusive exosomer, samt höljevirus.
Extracellulära blåsor (EVs) är membranbundna blåsor som frigörs av alla celltyper. De innehåller lipider, proteiner, metaboliter och nukleinsyror och överför dessa material lokalt mellan celler och distally mellan vävnader och organ. Det finns tre primära undertyper av EVs: apoptotiska kroppar, mikrovesicles och exosomer1,2. Här fokuserar vi vår diskussion på exosomer och deras tillhörande proteiner.
Exosomer är utsöndrade blåsor som härrör från inåtgående spirande av tidiga endosomer i den multivesikulära kroppen (MVB). MVB smälter sedan samman med plasmamembranet och släpper ut exosomerna i det extracellulära utrymmet för att resa till andra celler3,4. Exosomer finns på ett spektrum av storlekar från 40 till 150 nm och är berikade med endosomala transmembranproteiner som kallas tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbunden endosomal sorteringskomplex som krävs för transporten (ESCRT) och lipidflotteassocierade proteiner1,2,5,6,7.
Att karakterisera exosomernas biokemiska sammansättning har blivit ett populärt område för forskare att bättre förstå deras funktionella natur. Många metoder finns för att visualisera och karakterisera exosomer, inklusive nanoskala flöde cytometri, nanopartikelspårningsanalys (NTA), skannings- och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ytplasmonresonans, resistiv pulsavkänning och traditionell ljusmikroskopi, som var och en innehåller inneboende fördelar och nackdelar8,9. TEM och cryo-EM kan uppnå nanometerbaserad upplösning, men kräver ofta uttorkning och frysfraktursteg och därmed krymper eller lysar EVs10,11. NTA förlitar sig på ljusspridning, vilket möjliggör karakterisering av hundratals EVs åt gången, men är en indirekt mätning av partikelstorlek och kan inte enkelt skilja mellan EVs, virus och proteinaggregat12,13,14,15,16. Nanoskala flöde cytometri använder ljusspridning från en excitationsväg, som sedan kan översättas till storleksmätningar, men är en framväxande teknik, och det finns lite konsensus om vilken storlek på partiklar som ligger inom det linjära detektionsområdet för olika instrument12,17,18.
Traditionell ljusmikroskopi med fluorescerande proteiner eller färgämnen har varit en av de mest använda teknikerna för att visualisera subcellulära fack, proteinkomplex och signalmaskiner i en cell. Medan denna teknik visar sig användbar för att visualisera lokalisering av komplex, förhindrar diffraktionsgränsen för traditionell ljusmikroskopi (cirka 250-400 nm) den tydliga upplösningen av proteiner eller strukturer i det typiska storleksområdet för en exosom (40-150 nm)12,19,20.
Superupplösningsmikroskopi, nämligen direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM), skiljer sig från konventionell ljusmikroskopi genom att använda de fotowitchable egenskaperna hos specifika fluoroforer och upptäcka dessa blinkande händelser för att rekonstruera bilder ner till nanometerprecision21. Fotowitching händelser samlas in med hjälp av en hög-framerate detekteringskamera under loppet av tiotusentals individuella exponeringar, och en punktspridningsfunktion används för att med hög säkerhet kartlägga den exakta platsen för den fotowitching fluorophore19,20,22. Detta gör det möjligt för dSTORM att kringgå diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Flera grupper har rapporterat användningen av superupplösningstekniker för att visualisera och spåra exosomer och deras associerade proteiner22,23,24,25. Den slutliga upplösningen beror på fluoroforens biofysiska egenskaper, men sträcker sig ofta från +/-10-100 nm längs XY-axeln, vilket möjliggör enmolekylsupplösning.
Förmågan att lösa enskilda fluoroforer i denna skala på XY-axeln har revolutionerat mikroskopi. Det finns dock lite data om den tredimensionella (3D) dSTORM av en exosom. Därför försökte vi upprätta ett standardförfarande (SOP) för dSTORM-baserad visualisering och karakterisering av renade EVs, inklusive exosomer till nanometerprecision i 3D.
EVs har blivit ett populärt studieområde på grund av deras viktiga roll i många intracellulära processer och cell-till-cell-signalering1,30. Deras visualisering visar sig dock vara svår eftersom deras lilla storlek faller under diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) är en direkt visualiseringsmetod som kringgår diffraktionsgränsen genom att fånga fotowitching händelser av enskilda fluorofor…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Oxford Nanoimaging för deras konstruktiva feedback och vägledning. Detta arbete finansierades av 5UM1CA121947-10 till R.P.M. och 1R01DA040394 till D.P.D.
15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
RNase A | Promega | A797C | |
T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |