Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

Summary

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV’s) worden door alle celtypen vrijgegeven en spelen een belangrijke rol bij celsignalering en homeostase. De visualisatie van EV’s vereist vaak indirecte methoden vanwege hun kleine diameter (40-250 nm), die onder de diffractielimiet van typische lichtmicroscopie ligt. We hebben een op superresolutiemicroscopie gebaseerde visualisatie van EV’s ontwikkeld om de diffractielimiet in zowel twee als drie dimensies te omzeilen. Met behulp van deze aanpak kunnen we de driedimensionale vorm van EV’s oplossen tot binnen +/- 20 nm resolutie op de XY-as en +/- 50 nm resolutie langs de Z-as. Concluderend stellen we voor dat superresolutiemicroscopie wordt beschouwd als een karakteriseringsmethode van EV’s, inclusief exosomen, evenals omhulde virussen.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn membraangebonden blaasjes die door alle celtypen worden afgegeven. Ze bevatten lipiden, eiwitten, metabolieten en nucleïnezuren en dragen deze materialen lokaal over tussen cellen en distaal tussen weefsels en organen. Er zijn drie primaire subtypen van EV’s: apoptotische lichamen, microvesicles en exosomen^1,2. Hier richten we onze discussie op exosomen en hun bijbehorende eiwitten.

Exosomen zijn uitgescheiden blaasjes afkomstig van de inwaartse ontluiking van vroege endosomen in het multivesiculaire lichaam (MVB). De MVB smelt vervolgens met het plasmamembraan, waardoor de exosomen in de extracellulaire ruimte vrijkomen om naar andere cellen te reizen^3,4. Exosomen bestaan op een spectrum van groottes variërend van 40 tot 150 nm en zijn verrijkt met endosomale transmembraaneiwitten die bekend staan als tetraspaninen (CD9, CD63, CD81), membraangebonden endosomale sorteercomplex dat nodig is voor het transport (ESCRT) en lipide vlot-geassocieerde eiwitten^1,2,5,6,7.

Het karakteriseren van de biochemische samenstelling van exosomen is een populair veld geworden voor onderzoekers om hun functionele aard beter te begrijpen. Er bestaan veel methoden voor het visualiseren en karakteriseren van exosomen, waaronder flowcytometrie op nanoschaal, nanodeeltjesvolganalyse (NTA), scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), oppervlakteplasmonresonantie, resistieve pulsdetectie en traditionele lichtmicroscopie, die elk intrinsieke voor- en nadelen bevatten^8,9. TEM en cryo-EM kunnen een op nanometer gebaseerde resolutie bereiken, maar vereisen vaak uitdrogings- en vriesbreekstappen, waardoor EV’s^{10, 11}krimpen of liggen. NTA vertrouwt op lichtverstrooiing, waardoor de karakterisering van honderden EV’s tegelijk mogelijk is, maar is een indirecte meting van de deeltjesgrootte en kan niet gemakkelijk onderscheid maken tussen EV’s, virussen en eiwitaggregaten^{12,13,14,15,16}. Nanoschaal flowcytometrie maakt gebruik van lichtverstrooiing van een excitatiepad, dat vervolgens kan worden vertaald in groottemetingen, maar is een opkomende technologie, en er is weinig consensus over welke grootte van deeltjes zich binnen het lineaire detectiebereik bevinden voor verschillende instrumenten^12,17,18.

Traditionele lichtmicroscopie met behulp van fluorescerende eiwitten of kleurstoffen is een van de meest gebruikte technieken voor het visualiseren van subcellulaire compartimenten, eiwitcomplexen en signaleringsmachines in een cel. Hoewel deze techniek nuttig blijkt bij het visualiseren van de lokalisatie van complexen, voorkomt de diffractielimiet van traditionele lichtmicroscopie (ongeveer 250-400 nm) de duidelijke resolutie van eiwitten of structuren in het typische groottebereik van een exosoom (40-150 nm)^12,19,20.

Superresolutiemicroscopie, namelijk directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM), onderscheidt zich van conventionele lichtmicroscopie door gebruik te maken van de fotoschakelbare eigenschappen van specifieke fluoroforen en deze knipperende gebeurtenissen te detecteren om beelden tot nanometerprecisie te reconstrueren²¹. Fotoswitchinggebeurtenissen worden verzameld met behulp van een detectiecamera met hoge framesnelheid in de loop van tienduizenden individuele belichtingen, en een puntspreidingsfunctie wordt gebruikt om met hoge betrouwbaarheid de exacte locatie van de fotoswitching fluorofoor^19,20,22in kaart te brengen. Hierdoor kan dSTORM de diffractielimiet van lichtmicroscopie omzeilen. Verschillende groepen hebben het gebruik van superresolutietechnieken gemeld voor het visualiseren en volgen van exosomen en hun bijbehorende eiwitten^22,23,24,25. De uiteindelijke resolutie hangt af van de biofysische eigenschappen van de fluorofoor, maar varieert vaak van +/-10-100 nm langs de XY-as, waardoor een resolutie van één molecuul mogelijk is.

Het vermogen om individuele fluoroforen op deze schaal op de XY-as op te lossen, heeft een revolutie teweeggebracht in de microscopie. Er zijn echter weinig gegevens over de driedimensionale (3D) dSTORM van een exosoom. Daarom hebben we geprobeerd een standaard operationele procedure (SOP) vast te stellen voor dSTORM-gebaseerde visualisatie en karakterisering van gezuiverde EV’s, inclusief exosomen tot nanometerprecisie in 3D.

Protocol

1 Voortplanting en onderhoud van cellijnen Verkrijg menselijke osteosarcoomcellen (U2OS) en plaats de cellen in het groeimedium aangevuld met 10% exosoomvrij foetaal runderserum en 1x penicilline / streptomycine-oplossing.OPMERKING: Exosoomvrij foetaal runderserum werd gegenereerd volgens het protocol dat wordt gepresenteerd in McNamara et. al.26. Houd de U2OS-cellen in een met koper beklede incubator op 37 °C in 5% CO2 en doorgangscellen in T175-kolven<sup clas…

Representative Results

Het doel van deze studie was om de effectiviteit van superresolutiemicroscopie te evalueren bij het visualiseren van individuele EV’s met nanometerresolutie in drie dimensies (3D). Om de vorm en grootte van individuele EV’s te analyseren, gebruikten we fotoschakelbare kleurstof en incubeerden we de EV’s met een verrode, membraanintercalerende kleurstof en verwijderden we overtollige kleurstof door middel van chromatografie29. De affiniteit-vastgelegde anti-CD81 en roodgekleurde EV’s werden vervolg…

Discussion

EV’s zijn een populair studiegebied geworden vanwege hun belangrijke rol in veel intracellulaire processen en cel-naar-cel signalering^1,30. Hun visualisatie blijkt echter moeilijk te zijn omdat hun kleine formaat onder de diffractielimiet van lichtmicroscopie valt. Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) is een directe visualisatiemethode die de diffractielimiet omzeilt door fotoswitchinggebeurtenissen van individuele fluoroforen in de lo…

Materials

15 µ-Slide 8 well plates	Ibidi	80827
1X PBS	Gibco	14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution	Gibco	15140-122
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus	Genesee	25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter	Cytiva	29-0142-95
AKTA Flux S	Cytiva	29-0384-37
AKTA Start	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads	Thermo Fisher	10616D
B-cubed buffer	ONI	BCA0017
CellMask Red	Thermo Fisher	C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10566016
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Frac 30 Fraction collector	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0	Thermo Fisher	BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column	Cytiva	17548151
Molecular Biology Grade Water	Corning	9820003
Nanoimager	Oxford Nanoimaging	Custom
Paraformaldehhyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Polyethylene glycol	Thermo Fisher	BP233-1
RNase A	Promega	A797C
T175 Flasks	Genesee	25-211
Tetraspek microspheres	Invitrogen	T7279
Tris- HCl pH=7.5	Thermo Fisher	BP153-1
Unicorn V	Cytiva	29022094-ECOMINSSW