Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner

Summary

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM) brukes til å omgå den typiske diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi og for å se eksosomer på nanometerskalaen. Det kan brukes i både to og tre dimensjoner for å karakterisere eksosomer.

Abstract

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) frigjøres av alle celletyper og spiller en viktig rolle i cellesignalering og homeostase. Visualiseringen av elbiler krever ofte indirekte metoder på grunn av deres lille diameter (40-250 nm), som er under diffraksjonsgrensen for typisk lysmikroskopi. Vi har utviklet en mikroskopibasert visualisering av elbiler med superoppløsning for å omgå diffraksjonsgrensen i både to og tre dimensjoner. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan vi løse den tredimensjonale formen på elbiler til innenfor +/- 20 nm oppløsning på XY-aksen og +/- 50 nm oppløsning langs Z-aksen. Til slutt foreslår vi at mikroskopi med superoppløsning betraktes som en karakteriseringsmetode for elbiler, inkludert eksosomer, samt innkapslede virus.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbundne vesikler utgitt av alle celletyper. De inneholder lipider, proteiner, metabolitter og nukleinsyrer og overfører disse materialene lokalt mellom celler og distalt mellom vev og organer. Det finnes tre primære undertyper av elbiler: apoptotiske legemer, mikrovesikler og eksosomer^1,2. Her fokuserer vi vår diskusjon på eksosomer og deres tilknyttede proteiner.

Eksosomer utskilles vesicles som stammer fra innadvendt spirende tidlige endosomer inn i multivesicular kroppen (MVB). MVB smelter deretter sammen med plasmamembranen, og frigjør eksosomene i det ekstracellulære rommet for å reise til andre celler^3,4. Eksosomer finnes på et spekter av størrelser fra 40 til 150 nm og er beriket med endosomale transmembraneproteiner kjent som tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbundet endosomal sorteringskompleks som kreves for transport (ESCRT) og lipidflåterelaterte proteiner^1,2,5,6,7.

Karakterisering av den biokjemiske sammensetningen av eksosomer har blitt et populært felt for forskere å bedre forstå deres funksjonelle natur. Det finnes mange metoder for visualisering og karakterisering av eksosomer, inkludert nanoskala strømningscytometri, nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), skanning og overføringselektronmikroskopi (TEM), overflateplasmonresonans, resistiv pulssensor og tradisjonell lysmikroskopi, som hver inneholder egen fordeler og ulemper^8,9. TEM og cryo-EM kan oppnå nanometerbasert oppløsning, men krever ofte dehydrerings- og frysebruddtrinn, og dermed krympe eller lyse elbiler^10,11. NTA er avhengig av lysspredning, noe som gjør det mulig å karakterisere hundrevis av elbiler om gangen, men er en indirekte måling av partikkelstørrelse og kan ikke enkelt skille mellom elbiler, virus og proteinmengder^{12,13,14,15,16}. Nanoskala strømningscytometri bruker lysspredning fra en eksitasjonsbane, som deretter kan oversettes til størrelsesmålinger, men er en fremvoksende teknologi, og det er liten konsensus om hvilken størrelse partikler er innenfor det lineære deteksjonsområdet for ulike instrumenter^12,17,18.

Tradisjonell lysmikroskopi ved hjelp av fluorescerende proteiner eller fargestoffer har vært en av de mest brukte teknikkene for visualisering av subcellulære rom, proteinkomplekser og signalmaskiner i en celle. Selv om denne teknikken viser seg nyttig for å visualisere lokaliseringen av komplekser, forhindrer diffraksjonsgrensen for tradisjonell lysmikroskopi (rundt 250-400 nm) den klare oppløsningen av proteiner eller strukturer i det typiske størrelsesområdet til et eksosom (40-150 nm)^12,19,20.

Superoppløselig mikroskopi, nemlig direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM), skiller seg fra konvensjonell lysmikroskopi ved å bruke de fotobryterbare egenskapene til spesifikke fluoroforer og oppdage disse blinkende hendelsene for å rekonstruere bilder ned til nanometerpresisjon²¹. Photoswitching-hendelser samles inn ved hjelp av et høyt bildefrekvensdeteksjonskamera i løpet av titusenvis av individuelle eksponeringer, og en punktspredningsfunksjon brukes til å kartlegge med høy tillit den nøyaktige plasseringen av den fotobryter fluoroforen^19,20,22. Dette gjør at dSTORM kan omgå diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi. Flere grupper har rapportert bruk av superoppløsningsteknikker for visualisering og sporing av eksosomer og tilhørende proteiner^22,23,24,25. Den endelige oppløsningen avhenger av fluoroforens biofysiske egenskaper, men varierer ofte fra +/-10-100 nm langs XY-aksen, noe som tillater enkeltmolekyloppløsning.

Evnen til å løse individuelle fluoroforer i denne skalaen på XY-aksen har revolusjonert mikroskopi. Det er imidlertid lite data om den tredimensjonale (3D) dSTORM av et eksosom. Derfor forsøkte vi å etablere en standard operasjonsprosedyre (SOP) for dSTORM-basert visualisering og karakterisering av rensede elbiler, inkludert eksosomer til nanometerpresisjon i 3D.

Protocol

1 Overføring og vedlikehold av cellelinjer Skaff deg humane osteosarkomceller (U2OS) og plasser cellene i vekstmediet supplert med 10% exosome-fri Fetal Bovine Serum og 1x Penicillin / Streptomycin løsning.MERK: Exosome-free Fetal Bovine Serum ble generert etter protokollen presentert i McNamara et. al.26. Vedlikehold U2OS-cellene i en kobberbelagt inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 og passasjeceller i T175-kolber26,<sup class="xr…

Representative Results

Målet med denne studien var å evaluere effektiviteten av superoppløsningsmikroskopi ved visualisering av individuelle elbiler med nanometeroppløsning i tre dimensjoner (3D). For å analysere formen og størrelsen på individuelle elbiler, brukte vi fotoswitchable fargestoff og inkuberte ELBIL-ene med et fjernt rødt, membraninterkalerende fargestoff, og fjernet overflødig fargestoff gjennom kromatografi29. De affinitetsfangede anti-CD81 og rødfargede ELBILER ble deretter sett i superoppløsn…

Discussion

Elbiler har blitt et populært studieområde på grunn av deres viktige rolle i mange intracellulære prosesser og celle-til-celle-signalering^1,30. Imidlertid viser visualiseringen seg å være vanskelig ettersom deres lille størrelse faller under diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi. Direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM) er en direkte visualiseringsmetode som omgår diffraksjonsgrensen ved å fange fotobryterhendelser av individuelle flu…

Materials

15 µ-Slide 8 well plates	Ibidi	80827
1X PBS	Gibco	14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution	Gibco	15140-122
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus	Genesee	25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter	Cytiva	29-0142-95
AKTA Flux S	Cytiva	29-0384-37
AKTA Start	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads	Thermo Fisher	10616D
B-cubed buffer	ONI	BCA0017
CellMask Red	Thermo Fisher	C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10566016
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Frac 30 Fraction collector	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0	Thermo Fisher	BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column	Cytiva	17548151
Molecular Biology Grade Water	Corning	9820003
Nanoimager	Oxford Nanoimaging	Custom
Paraformaldehhyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Polyethylene glycol	Thermo Fisher	BP233-1
RNase A	Promega	A797C
T175 Flasks	Genesee	25-211
Tetraspek microspheres	Invitrogen	T7279
Tris- HCl pH=7.5	Thermo Fisher	BP153-1
Unicorn V	Cytiva	29022094-ECOMINSSW