Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa de vesículas extracelulares en tres dimensiones
Summary
La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) se utiliza para eludir el límite de difracción típico de la microscopía de luz y para ver los exosomas a escala nanométrica. Se puede emplear tanto en dos como en tres dimensiones para caracterizar exosomas.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son liberadas por todos los tipos de células y desempeñan un papel importante en la señalización celular y la homeostasis. La visualización de los vehículos eléctricos a menudo requiere métodos indirectos debido a su pequeño diámetro (40-250 nm), que está por debajo del límite de difracción de la microscopía de luz típica. Hemos desarrollado una visualización basada en microscopía de superresolución de vehículos eléctricos para evitar el límite de difracción en dos y tres dimensiones. Usando este enfoque, podemos resolver la forma tridimensional de los evs a una resolución de +/- 20 nm en el eje XY y una resolución de +/- 50 nm a lo largo del eje Z. En conclusión, proponemos que la microscopía de superresolución se considere como un método de caracterización de los EV, incluidos los exosomas, así como los virus envueltos.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EV) son vesículas unidas a la membrana liberadas por todos los tipos de células. Contienen lípidos, proteínas, metabolitos y ácidos nucleicos y transfieren estos materiales localmente entre las células y distalmente entre los tejidos y órganos. Hay tres subtipos principales de EV: cuerpos apoptóticos, microvesículas y exosomas1,2. Aquí, centramos nuestra discusión en los exosomas y sus proteínas asociadas.
Los exosomas son vesículas secretadas que se originan en la brotación interna de los endosomas tempranos en el cuerpo multivesicular (MVB). El MVB luego se fusiona con la membrana plasmática, liberando los exosomas en el espacio extracelular para viajar a otras células3,4. Los exosomas existen en un espectro de tamaños que van de 40 a 150 nm y están enriquecidos con proteínas transmembrana endosómicas conocidas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), complejo de clasificación endosomal unido a la membrana requerido para el transporte (ESCRT) y proteínas asociadas a balsas lipídicas1,2,5,6,7.
La caracterización de la composición bioquímica de los exosomas se ha convertido en un campo popular para que los investigadores comprendan mejor su naturaleza funcional. Existen muchos métodos para visualizar y caracterizar exosomas, incluida la citometría de flujo a nanoescala, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), la microscopía electrónica de barrido y transmisión (TEM), la resonancia de plasmón de superficie, la detección de pulsos resistivos y la microscopía de luz tradicional, cada una de las cuales contiene pros y contras intrínsecos8,9. TEM y cryo-EM pueden lograr una resolución basada en nanómetros, pero a menudo requieren pasos de deshidratación y congelación-fractura, lo que reduce o lisa los EV10,11. NTA se basa en la dispersión de la luz, lo que permite la caracterización de cientos de EV a la vez, pero es una medida indirecta del tamaño de partícula y no puede distinguir fácilmente entre EV, virus y agregados de proteínas12,13,14,15,16. La citometría de flujo a nanoescala emplea la dispersión de la luz desde una ruta de excitación, que luego se puede traducir en mediciones de tamaño, pero es una tecnología emergente, y hay poco consenso sobre qué tamaño de partículas están dentro del rango lineal de detección para varios instrumentos12,17,18.
La microscopía de luz tradicional que utiliza proteínas fluorescentes o colorantes ha sido una de las técnicas más empleadas para visualizar compartimentos subcelulares, complejos de proteínas y maquinaria de señalización dentro de una célula. Si bien esta técnica resulta útil para visualizar la localización de complejos, el límite de difracción de la microscopía de luz tradicional (alrededor de 250-400 nm) impide la resolución clara de proteínas o estructuras en el rango de tamaño típico de un exosoma (40-150 nm)12,19,20.
La microscopía de superresolución, es decir, la microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM), se distingue de la microscopía de luz convencional al emplear las propiedades fotoconmutables de fluoróforos específicos y detectar estos eventos parpadeantes para reconstruir imágenes con una precisión nanométrica21. Los eventos de photoswitching se recopilan utilizando una cámara de detección de alta velocidad de fotogramas en el transcurso de decenas de miles de exposiciones individuales, y se utiliza una función de dispersión de puntos para mapear con alta confianza la ubicación exacta del fluoróforo fotoconmutante19,20,22. Esto permite a dSTORM eludir el límite de difracción de la microscopía de luz. Varios grupos han reportado el uso de técnicas de superresolución para visualizar y rastrear exosomas y sus proteínas asociadas22,23,24,25. La resolución final depende de las propiedades biofísicas del fluoróforo, pero a menudo oscila entre +/-10-100 nm a lo largo del eje XY, lo que permite una resolución de una sola molécula.
La capacidad de resolver fluoróforos individuales a esta escala en el eje XY ha revolucionado la microscopía. Sin embargo, hay pocos datos sobre el dSTORM tridimensional (3-D) de un exosoma. Por lo tanto, buscamos establecer un procedimiento operativo estándar (SOP) para la visualización y caracterización basada en dSTORM de EV purificados, incluidos los exosomas con precisión nanométrica en 3-D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los EV se han convertido en un área de estudio popular debido a su importante papel en muchos procesos intracelulares y señalización de célula a célula1,30. Sin embargo, su visualización resulta difícil ya que su pequeño tamaño cae por debajo del límite de difracción de la microscopía de luz. La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es un método directo de visualización que evita el límite de difracción capturando e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Oxford Nanoimaging por sus comentarios constructivos y orientación. Este trabajo fue financiado por el 5UM1CA121947-10 a R.P.M. y el 1R01DA040394 a D.P.D.
Materials
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
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