この方法の目的は、マウスモデルにおける温熱療法または熱誘発発作をスクリーニングすることである。このプロトコルは、体温の上昇が発作につながるかどうかを判断するために、体温の継続的な監視を備えたカスタムメイドのチャンバの使用を記述しています。
トランスジェニックマウスモデルは、てんかんを含むヒト神経学的障害の様々な側面を研究する上で強力なツールであることが証明されている。 SCN1A関連遺伝子てんかんは、不完全な浸透度および臨床的変動性を有する広範囲の発作性障害を含む。SCN1A変異は、単純で自己限定的な発熱関連熱性けいれん(FS)、熱性けいれんプラスを伴う中等度の遺伝子てんかん(GEFS+)からより重篤なDravet症候群(DS)まで、多種多様な発作表現型をもたらし得る。FSは遺伝子てんかんを患っていない6〜7歳未満の小児に一般的に見られるが、GEFS+患者のFSは成人期まで引き続き発生する。伝統的に、実験FSは、動物を乾燥空気または加熱ランプの流れに曝露することによってマウスにおいて誘導され、そして体温の変化速度はしばしば十分に制御されていない。ここでは、デジタル温度コントローラとヒーターを備えた扇風機を備えたプレキシガラスフロントを備えたカスタムメイドの加熱チャンバを説明し、加熱された強制空気を温度制御された方法でテストアリーナに送ることができます。直腸プローブを介して監視されるチャンバー内に配置されたマウスの体温は、チャンバー内の温度を上昇させることによって再現可能な方法で40〜42°Cに上昇させることができる。加熱期間中の動物の継続的な視覚的モニタリングは、野生型の同腹仔における行動発作を誘発しない体温でFS変異を有するマウスにおける熱誘発性発作の誘発を実証する。動物はチャンバーから簡単に取り出して冷却パッドの上に置き、体温を急速に正常に戻すことができます。この方法は、てんかんマウスモデルにおける熱誘発発作の発生のための単純で迅速で再現性のあるスクリーニングプロトコルを提供する。
てんかんは、米国で4番目に一般的な神経学的障害のファミリー1であり、再発性発作を引き起こすCNSにおける興奮性および抑制性ドライブの不均衡によって特徴付けられる。熱性発作(FS)または発熱関連発作は、一般集団において、最も頻繁には、3ヶ月から6〜7歳までの小児において起こり得る。しかし、遺伝子変異を有する一部の個体では、ほとんどの場合、ナトリウムチャネル遺伝子において、FSは成人期まで7歳を超えて持続し得る。この状態は、熱性けいれんプラスまたはFS+と呼ばれる。ゲノムシーケンシングの急速な進歩により、ヒトナトリウムイオンチャネル遺伝子SCN1Aに1,300以上の変異が同定され、てんかん変異のホットスポットとなっています。SCN1A変異は、熱性けいれん(FS)、熱性けいれんプラスを伴う遺伝子てんかん(GEFS+)、およびDravet症候群(DS)2,3,4,5,6を含む広範囲の発作性障害に関連している。SCN1Aミスセンス変異の約20%がGEFS+5,7,8につながる。小児期の複雑または長期のFSの小児病歴は、その後、側頭葉てんかん(TLE)9,10,11などのより衰弱性の形態のてんかんに発展し得る。Dravet症候群は、SCN1Aの切り詰め変異または機能喪失変異のために生じ、難治性てんかんの重篤な形態であり、難治性発作に発症する熱性発作の小児期に発症し、しばしば認知障害、発達障害および運動障害と関連している2,5,12。.GEFS+および/またはDSを有する多くの個体は熱性けいれんを示すので、これらの発作性障害とよりよく闘うための新しい治療法を開発することが不可欠になる。
SCN1A関連てんかんの動物モデルは、さまざまな種類の発作(熱性発作と一般化)を特徴付け、発作発生のニューロンメカニズムを解剖する上で非常に貴重であることが証明されています13,14,15,16,17,18。げっ歯類の脳における脳波/EMG記録を介した自然発作の研究は十分に確立されており、非常に有用なツールであるが、マウスモデルにおける熱性発作を模倣しようとした研究はごくわずかである14、16、19、20、21、22、23。.以前の研究では、加熱された乾燥空気のジェット、または熱システムを備えたメタクリレートシリンダー、または密閉された試験arenas9,16,21,22,23,24の温度コントローラを備えたヒートランプを使用して、温熱療法を介して発作を誘発した。より制御された環境で体温を上昇させるために、ここで説明するプロトコルは、チャンバ内のマウスの体温の再現可能な上昇速度を可能にする温度制御加熱システムを備えたカスタムメイドのチャンバを使用する。熱室は木材(長さ40cm×幅34cm×高さ31cm)で構成され、K熱電対を備えたデジタル温度コントローラが取り付けられました。チャンバの背面パネルにヒーターを備えた小型の軸流ファンは、加熱された空気をデジタル温度コントローラによって調整されたチャンバに導きます。この強制空気加熱システムにより、チャンバ温度が上昇する速度を制御することができます。(図1A、B)。木製の熱室の内側にあるK熱電対は、デジタル温度コントローラにフィードバックを送信し、アッセイ中にボックス内の温度を一定に保ちます。デジタル温度コントローラに温度を設定すると、電動ファンは加熱された強制空気を通気口に送り、チャンバを均一に加熱することができます(図1A)。ヒートチャンバのフロントパネルは透明なプレキシガラスシートで、試験のビデオ録画を容易にします。
成体(P30−P40)マウス、GEFS+および同数の野生型同腹仔を対照群として働く原因となるSCN1Aにおけるミスセンス変異についてヘテロ接合性を、各実験について選択した。これらの研究で用いた動物(雄と雌の両方)は、体重が15g以上の野生型マウスは、同じ年齢の重い動物よりも熱誘発性発作に対してより敏感であった。パイロット研究では、変異型マウスと野生型マウスの両方が、チャンバーの後ろのより涼しい角を探し出し、長期間そこにとどまっていることが観察されました。これを回避するため、ヒートチャンバー試験アリーナ内の有効床面積は、チャンバーの右側に木製ブロックB(寸法20cm x 8cm x 7.2cm)を配置して、長さ16.5cm×幅21.5cm×高さ27.5cmに縮小した(図1A)。熱室は厚さ1.9cmの合板(長さ40cm×幅34cm×高さ31cm)で、白い積層体で覆われ、K熱電対を備えたデジタル温度コントローラが取り付けられました。チャンバ壁のラミネート表面は不浸透性であり、70%エタノールで拭き取ることによって試験の間に容易に消毒することができる。ヒートチャンバの温度を最初に50°Cに設定し、実験開始前に少なくとも1時間予熱し、チャンバ内の均一な加熱を確保した。各マウスには、実験全体を通して体温を連続的にモニタリングするための直腸体温計を取り付けた。一度に1匹のマウスをチャンバーに入れ、1分〜10分の間、温度を50°Cに保った。その後、11~20分間55°Cまで昇温し、最後に21~30分間60°Cまで昇温した。これにより、マウス体温の上昇速度が再現可能であった(図2A)。各試験はビデオ録画され、行動分析はオフラインで実施された。
加熱プロトコルは、加熱チャンバの初期温度およびチャンバが加熱される速度を変更するように容易に変更することができ、これにより、アッセイ中にマウスの体温が上昇する速度が変化する。したがって、この方法は、熱誘発発作を含む行動スクリーンを設定する際に、従来の方法よりも柔軟性が高い。熱誘発性発作プロトコルは、変異マウスを熱誘発性発作に対してより耐性にするか、または発作が観察される閾値温度を上昇させる抗てんかん薬をスクリーニングするためにも使用することができる。同様に、熱誘発性発作に対するケト食などの制限的食生活レジームの有益な効果は、通常のチャウ給餌マウスとケト給餌マウスで調べることができる。
図1:カスタムメイドのマウスヒートチャンバの説明(A)木製マウスヒートチャンバのフロントパネルには、デジタル温度コントローラ、K熱電対、ファンヒーターのON/OFFスイッチ、および熱インジケータをオンにする電源ON/OFFスイッチを含むサイドコントロールパネルが表示されます。ボックスと内側のテストアリーナの外形寸法はcmで示されています。試験アリーナ表面を効果的に縮小するために使用される木製ブロックBも示されている。試験アリーナの底部は、マウスが加熱された木の表面に直接接触するのを防ぐために、穂軸の寝具で覆われています。(B)ヒートチャンバの背面パネルには、上部の通気口に取り付けられたファンと、チャンバに電気を供給するための電源コードが表示されます。この図は、Das et al., 2021, eNeuro14の図3から修正されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
我々は、ヒト患者における熱性発作の行動と同等の行動であるマウスにおける熱誘発性発作の発生をスクリーニングするための簡単で効果的なプロトコールを記述する。アッセイは、いくつかのパラメータ−発作を示すマウスの割合、発作閾値、ラシーンスケールでの発作の重症度を含む、体温の上昇に対する対照マウス群および試験マウス群の感受性を比較するために評価する。
このプロトコルの重要なステップは、マウスの体温を継続的に監視しながらチャンバ内の熱を増加させることを含む。野生型動物は体温>44°Cで熱誘発性発作を起こす可能性があるため、これらのアッセイでマウスが経験する最高体温は44°Cであることが不可欠です。 全身麻酔または鎮痛薬による前処理は、動物の深部体温を低下させたり、体温調節を妨げたりして、発作閾値温度データ収集を混乱させる可能性があります。したがって、このスクリーニングプロトコール下のマウスは、30分間の試験ウィンドウ中にこれらの薬剤を提供することができなかった。すべての手続きは、機関のIACUC委員会によって承認されなければなりません。アッセイ中のマウスの深部体温の継続的なモニタリングを確実にするために、直腸温度プローブをマウスの尾部にしっかりとテープで固定する。アッセイ中に、マウス体温がマウスチャンバーの温度を上昇させた後でさえも長期間にわたって変化しないままであることが判明した場合、直腸温度プローブがマウスから出てこないか、または尾部に緩く取り付けられていることを確認する。
マウスモデルの遺伝的背景は、SCN1A変異および薬理学的に誘導された発作に対する感受性に影響を及ぼし得る18、25、26、27。上記の結果で論じたように、マウスの遺伝的背景は、熱誘発性発作に対する感受性に影響を及ぼす可能性がある。Scn1aK1270T GEFS+変異マウスを、129X1およびB6NJの2つの遺伝的背景で試験し、発作感受性B6NJバックグラウンドにおける野生型マウスのわずかな割合(33%)も、熱誘発発作を受けることが観察された。しかし、ヘテロ接合型変異体Scn1aKT/+マウスと比較して、B6NJ野生型マウスは有意に高い温度閾値で熱誘導性発作を経験した。これは、CRISPRノックインによって導入された遺伝子変異(Scn1a K1270T)が、変異マウスを温熱療法誘発発作に対してより感受性にすることを確認する。
このプロトコルを採用することにはいくつかの利点があり、以下に要約します。第1に、乾燥空気の流れや加熱されたランプの使用とは異なり、密閉された空間内に設置された温度制御された強制空気は、実験者が所望の速度で試験アリーナを加熱することをより詳細に制御することを可能にする。加熱プロトコルのステップは、開始温度、各ステップの持続時間などを増減するように簡単に変更して、ラットなどの重く、またはより大きなげっ歯類である高齢マウスをスクリーニングすることができる。第2に、添付の直腸プローブを介したマウス体温の継続的なモニタリングは、アッセイ全体を通して、個々のマウスにおける体温変化の速度に関する貴重な情報を与える。これにより、実験者は、このプロトコルを他の試験分野に適応させる際に、マウスの温度変化率が0.25-0.5°C/分を超えないことを注意深く観察することができる(これは動物にとってストレスになるかもしれない)。重要なことに、異なるマウス群における経時的な体温の変化率は、体温調節能力に光を当てることができ、突然変異を引き起こす熱性けいれんがマウスの体温調節も変化させるかどうかを理解するのに役立つ可能性がある。第3に、継続的な体温モニタリングは、マウスが経験した発作の最初の発作と同時に記録されるため、このプロトコルを使用した発作閾値温度測定が正確であることを保証します。動物の体温が継続的に監視されていない場合、または動物を試験アリーナから連れ出した後に発作閾値温度が測定されない場合、発作閾値は、発作後のマウスを処理するのにかかる時間によって変化し得る。最後に、この方法は、ヒト患者の熱性発作を模倣するためにマウスに発熱を誘発する(病原体を注入することによって)侵襲的方法を使用する必要性を回避する。
このプロトコルの限界の1つは、幼い(年齢のP30未満)マウスを熱誘発性発作についてスクリーニングすることが困難であることです。このプロトコルは、成体マウス(P30-P40以上)の熱または温熱療法誘発発作に対する感受性をスクリーニングするために開発されました。我々の経験では、若い野生型マウス、特に体重が15g未満のマウスは、未発達の体温調節機構、生理学的熱ストレス、またはその両方の組み合わせに起因する可能性のある熱誘発性発作を受ける可能性がより高い。したがって、このプロトコルを使用して幼いマウスに熱誘発発作スクリーニングを行うことは理想的ではない。
マウスを熱誘発性発作にさらしながら脳波モニタリングを組み合わせた将来の研究は、以前の研究と同様に、熱誘発性発作の脳波発作パターンに光を当てることができる19。マウス脳内の特定の領域におけるニューロン活性は、脳組織を採取した後、光遺伝学的アプローチと免疫組織化学に基づく研究を組み合わせることによって追跡することができる。また、ケト食などの制限食が熱性けいれんを減少させる効果は、ケト給餌マウスおよび通常のチャウ給餌マウスを熱誘発性発作プロトコールに供することによって評価することができる。同様に、てんかん薬物スクリーニングパラダイムを開発して、ビヒクル給餌マウスまたは対照マウスと比較した場合、薬物供給または治療マウスにおける熱誘発発作を改善または抑制する抗てんかん薬候補を試験および同定することができる。
The authors have nothing to disclose.
コナー・J・スミスがカスタマイズされたマウス熱室の建設に協力してくれたことに感謝します。我々は、アッセイ開発の初期段階で加熱プロトコルを標準化するためのO’Dowdラボメンバー、リーシャ・ゼンおよびアンドリュー・サルガドの助けを認める。また、ダニー・ベナビデスとクマール・ペリンバムに、原稿の実験手順の一部をビデオ録画してくれたことにも感謝します。この研究は、D.O.D.に授与されたNIH助成金(NS083009)によって支援されました。
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