Protokollene beskriver høyytelses væskekromatografimetoder kombinert for å brytningsindeks eller massespektrometrisk deteksjon for å studere metabolske reaksjoner i komplekse lysatebaserte cellefrie systemer.
Teknisk cellulær metabolisme for målrettet biosyntese kan kreve omfattende design-build-test-learn (DBTL) sykluser som ingeniøren arbeider rundt cellens overlevelseskrav. Alternativt kan utføre DBTL-sykluser i cellefrie miljøer akselerere denne prosessen og lindre bekymringer med vertskompatibilitet. En lovende tilnærming til cellefri metabolsk engineering (CFME) utnytter metabolsk aktive råcelleekstrakter som plattformer for bioproduksjon og for raskt å oppdage og prototyping av modifiserte proteiner og veier. Å realisere disse funksjonene og optimalisere CFME-ytelsen krever metoder for å karakterisere metabolomen til lysatebaserte cellefrie plattformer. Det vil si at analytiske verktøy er nødvendige for å overvåke forbedringer i målrettede metabolittkonverteringer og i å belyse endringer i metabolittfluks ved manipulering av lysatmetabolisme. Her ble metabolittanalyser ved hjelp av høyytelses væskekromatografi (HPLC) kombinert med enten optisk eller massespektrometrisk deteksjon brukt til å karakterisere metabolittproduksjon og fluss i E. coli S30 lysater. Nærmere bestemt beskriver denne rapporten utarbeidelsen av prøver fra CFME-lysater for HPLC-analyser ved hjelp av brytningsindeksdeteksjon (RID) for å kvantifisere genereringen av sentrale metabolske mellomprodukter og biprodukter i konverteringen av lavkostnads substrater (dvs. glukose) til ulike produkter av høy verdi. Analysen av metabolittkonvertering i CFME-reaksjoner matet med 13C-merket glukose gjennom omvendt fase flytende kromatografi koblet til tandemmassespektrometri (MS / MS), et kraftig verktøy for å karakterisere spesifikke metabolittutbytter og lysat metabolsk flux fra startmaterialer, presenteres også. Til sammen gjør bruk av disse analytiske metodene på CFME lysatmetabolisme det mulig å fremme disse systemene som alternative plattformer for å utføre raskere eller nye metabolske ingeniøroppgaver.
Begrensninger i tekniske mikrober for kjemisk produksjon kan løses ved å rekapitlere biokjemiske reaksjoner in vitro der konkurrerende cellulære overlevelsesfunksjoner er fraværende1. Videre er det åpne reaksjonsmiljøet (dvs. fravær av cellemembran) mer egnet til manipulering og er lettere å overvåke sammenlignet med levende celler. Dette grunnleggende konseptet med cellefri metabolsk engineering (CFME) har blitt elegant demonstrert ved rekonstituering av metabolske veier for å syntetisere verdifulle kjemikalier som hydrogen og monoterpener med produksjonsmålinger som er størrelsesorden høyere enn presentert i mikrobielle cellefabrikker så langt1,2,3 . Metoder for rensing av hele veier er imidlertid for tiden begrenset av tid og kostnad. Alternativt kan cellefrie metabolske systemer avledes fra råcelleekstrakter gjennom raske og rimelige metoder i forhold til rekonstituering av hele banen4. Den sentrale metabolismen som beholdes i celleekstrakter kan suppleres med energisubstrater (f.eks. glukose og enzymatiske kofaktorer) og salter i bufrede løsninger for å generere sentrale metabolske forløpere i over 24 timer5,6. Ved å tilsette eksogene enzymer til den lysatebaserte CFME-reaksjonen, kan mer komplekse biotransformasjoner av glukose til mer verdifulle kjemikalier ved høye titere4,6,7. Selv om utbyttet har en tendens til å bli kompromittert i disse systemene på grunn av deres cellelignende metabolske kompleksitet, har unike metoder for å kuratere lysate proteomer for konvertering med høyere avkastning vært og utvikles7,8.
Den enkle å utføre metabolske transformasjoner i lysate-baserte cellefrie systemer gjør disse utmerkede plattformene for enten å flytte kjemisk produksjon utenfor cellen helt eller for å prototyping nye veier med høy gjennomstrømning før du bygger og tester disse designene in vivo2,9. For begge bruksområdene er verktøy for overvåking av metabolske konverteringer eller observasjon av generelle endringer i metabolsk flux i lysater integrert i utviklingen av CFME. Høyytelses væskekromatografi (HPLC) kan brukes til å skille de kjemiske bestanddelene av CFME-reaksjoner med høy oppløsning og kan kobles til optiske eller massespektrometriske detektorer for metabolitt kvantifisering5,10. Det underliggende prinsippet for HPLC er at analytter oppløst i et løsningsmiddel (dvs. mobilfase) og pumpet gjennom en kolonne vil samhandle med det spesifikke kolonneemballasjematerialet (dvs. stasjonær fase)11. Avhengig av deres kjemiske egenskaper, viser disse analyttene varierende oppbevaringstider før de til slutt blir unndratt fra den stasjonære fasen og båret av den mobile fasen til en detektor. Denne rapporten beskriver utarbeidelse og analyse av E. coli lysate-baserte CFME-reaksjoner gjennom HPLC-baserte metoder som utnytter RID og MS / MS-deteksjon.
HPLC koblet til refraktiv indeksdeteksjon (HPLC-RID) er en generelt tilgjengelig metode for raskt å identifisere sentrale metabolske forløpere og sluttprodukter. Kort sagt måler RID hvordan analytter endrer avbøyningen av lys av den mobile fase12. RID-signaler som tilsvarer målanalytter i prøver, kan deretter kvantifiseres ved sammenligninger med RID-signaler om standardløsninger. I CFME-programmer har denne deteksjonsmodusen blitt mest brukt med HPLC-kolonner som skiller forbindelser basert på en kombinasjon av størrelsesekskludering og ligandutvekslingsmekanismer, eller ionmoderert partisjonskromatografi5,6,8,13. Denne spesielle teknikken brukes til raskt å kvantifisere forbruket av sukkersubstrater som glukose samt dannelse av gjæringsprodukter som succinat, laktat, format, acetat og etanol i lysatebaserte CFME-reaksjoner8. Registrering av konsentrasjonsendringene til disse forbindelsene via HPLC har vært nyttig for både å belyse potensialet til råcelleekstrakter for å samle sentrale metabolske forløpere og forstå hvordan banefluks omdirigeres gjennom gjæringsveier under komplekse metabolske konverteringer fra glukose i lysater6,8,14. Seminal CFME-studier i E. coli-celleekstrakter bekrefter at gjæringsforbindelser akkumuleres som sluttprodukter av glukosekabolisme og forekommer også som uønskede biprodukter i lysater som overekspresserer eksogene enzymer6,15. Det foreslås at fermentativ metabolisme spiller en nødvendig rolle i å regenerere redoksekvivalenter av kofaktorer (dvs. NAD (P)H og ATP) for å opprettholde glykolytiske reaksjoner8. Derfor er en HPLC-basert optisk deteksjonsmetode designet for å skille gjæringsprodukter et nyttig og vanlig brukt verktøy når du utfører forskjellige lysatebaserte CFME-oppgaver.
CFME kan implementeres for å akkumulere metabolske sluttprodukter som ikke er karbohydrater, organiske syrer eller alkoholer4. Måling av mellomprodukter som forbrukes så raskt som de syntetiseres, kan også være ønskelig10. Mens HPLC-RID er tilgjengelig når det gjelder kostnader og vanskeligheter, er denne metoden begrenset av dens evne til bare å skille metabolitter basert på oppbevaringstid. Et bredere spekter av metabolitter kan analyseres når flytende kromatografi er koblet til MS/MS-deteksjon (LC-MS/MS)16. Ved denne metoden blir analytter i mobilfasen ionisert og differensialt oppdaget basert på hvert molekyls masse- og ladeegenskaper. Kunnskap om både metabolittens masse-til-kostnad (m / z) forhold og oppbevaringstid på kolonnen letter dermed separasjonen av de fleste metabolske mellomprodukter og sluttprodukter med høy oppløsning16. Denne deteksjonsteknikken kan også kobles til nano-væskekromatografi, som gir mye lavere strømningshastigheter og prøveinjeksjonsvolumer, noe som gir mer sensitiv deteksjon av små molekyler i den komplekse lysatbakgrunnen17. LC-MS/MS kan i tillegg brukes med isotopmerking siden innebygde etiketter gir endringer i analyttenes m/z-verdier18. Timepoint-målinger ekstrahert fra en CFME-reaksjon supplert med et 13C6-glukosesubstrat kan dermed bestemme ende- eller biproduktene som er avledet spesielt fra supplert glukose. Selv om denne isotopsporingsmetoden ennå ikke brukes ofte i CFME-studier, er det et kraftig verktøy for å forstå metabolske konverteringer i lysatebaserte CFME-systemer, spesielt siden salttellerioner (dvs. acetat og glutamat) i disse reaksjonene også er katabolisert som sekundære substrater19. Utnytte denne teknikken kan dermed tegne et omfattende bilde av glukosemetabolismen i lysater, som til denne dagen ikke er helt forstått. Her beskriver protokollen en metode for nano-flytende kromatografi koblet til nanoelektrosprayionisering (nano ESI) MS/MS som kan brukes til å forhøre en mulig modell for glukosemetabolisme, spesielt i E. coli lysates (Figur 1). Modellen er basert på rapporter om fermentative veier og pentosefosfatveien som er aktiv i E. coli lysater avledet fra stammer vokst i rike medier5,6,8,14. Teknikken brukes i tillegg til å undersøke aminosyreproduksjon siden dagens kunnskap om aminosyre anabolisme fra glukose i lysater er begrenset til noen få eksempler som syntese av aromatiske aminosyrer7. Gitt den mest polare naturen til sluttprodukter og mellomprodukter i disse veiene (dvs. organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer), ble omvendt faset væskekromatografi brukt her. Denne teknikken skiller polarforbindelser ved elution fra en ikke-polar stasjonær fase. Disse forbindelsene ble deretter ionisert av nano ESI i negativ ionmodus som tillater påvisning av analytter med minst en negativ elementær ladning og er dermed nyttig for å oppdage sure forbindelser. Denne teknikken brukes her for å analysere glukose-avledet 13C-inkorporerende metabolitter og demonstrerer nytten av LC-MS / MS for å forstå glukosemetabolisme i lysater.
Den skisserte HPLC-RID-tilnærmingen kan brukes til å kvantifisere sukkersubstratforbruk og etterfølgende konverteringer til store organiske syre- og alkoholprodukter av lysat sentral metabolisme over tid. Videre bruker denne protokollen en enkel isokratisk metode ved hjelp av en enkelt mobil fase, krever minimal prøvepreparering, og tillater en enkel målrettet nedstrømsanalyse. Analytter målt ved HPLC-RID-metoden utmerker seg utelukkende av oppbevaringstidene, og derfor deres interaksjoner med den valgte kolonneharpiksen. HPLC-kolonnen som brukes her, ble spesielt designet for å skille karbohydrater, organiske syrer og alkoholer ved å kombinere størrelsesekskludering og ligandutveksling (dvs. ion-moderert partisjonskromatografi). Den beskrevne metoden er derfor nyttig for mer målrettet analyse av karbohydratsubstrater og utvalgte sluttprodukter av glukosegjæringsveier som forventes å primært lette og energisere lysatebaserte biotransformasjoner8,15,21. Denne protokollen tar imidlertid ikke hensyn til aktivering av andre metabolske veier i celleekstrakter. Rørledninger som benytter andre kromatografiske separasjonsteknikker (dvs. hydrofil interaksjonskromatografi), gradient elutionmetoder, mer komplisert prøvepreparering (dvs. avledning) og forskjellige optiske detektorer (f.eks. ultrafiolett lys eller fordampende lysspredningsdetektorer) kan brukes til å oppdage andre metabolitter som aminosyrer og sukkerfosfater23,24 . Alternativt kan en global tilnærming til å studere lysatmetabolisme tas ved hjelp av LC-MS / MS.
Den beskrevne LC-MS/MS-metoden er en enkelt arbeidsflyt for måling og identifisering av et bredere spekter av metabolitter. LC-MS/MS er et toppmoderne analyseverktøy for metabolomprofilering på grunn av følsomheten og evnen til å skille mellom metabolitter ved oppbevaringstid og m/z-forhold med høy oppløsning16. Med fokus på sentrale karbonmetabolske veier og aminosyre anabolisme, negativ modus MS / MS ble implementert for å spesifikt oppdage polare organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer. Kombinert med en nano-væske kromatografi teknikk, gir metoden høy følsomhet for å oppdage små molekyler i den komplekse lysatbakgrunnen17. Når det gjelder profilering av lysatbasert CFME-metabolisme, er imidlertid en begrensning av den beskrevne LC-MS / MS-protokollen dens nedre deteksjonsgrense på 50 m / z, som utelukker måling av etanol, et hovedprodukt i lysat glukosemetabolisme, samt format, som begge ellers lett kvantifiseres av den detaljerte HPLC-RID-metoden. Sammenlignet med LC-MS/MS har HPLC-RID den ekstra fordelen med relativ tilgjengelighet når det gjelder kostnader og vanskeligheter. Til sistnevnte punkt kan feilsøking av LC-MS/MS-metoden som er beskrevet her, kreve en viss grad av ekspertise innen massespektrometri. Likevel har MS-deteksjon unikt tiltalende applikasjoner over RID, da det i tillegg kan skille merkede isotoper i metabolomer, en utmerket teknikk for å forstå karbonbevegelse fra supplerte substrater gjennom det komplekse lysate metabolske nettverket18. En slik tilnærming ble brukt her ved å supplere reaksjoner med 13C6-glukose og analysere de relative overflodsverdiene til nedstrøms 13C-inkorporerende metabolitter. Analysen tillot definisjonen av aktive og inaktive veier, støttet tidligere rapporterte forutsetninger og ga ny innsikt om metabolsk flux i lysater. Endringer kan også gjøres innenfor metoden for spesifikke analyser. For eksempel kan standardløsninger av 13C-merkede målforbindelser analyseres sammen med prøver for å oppnå absolutte kvantitative målinger av glukoseavledede molekyler over tid og konkludere om fluksfordelinger. Bedre deteksjon av positivt ladede forbindelser kan også aktiveres i gjeldende arbeidsflyt ved å kjøre sekvenser med METH-filer justert for registrering av positiv modus.
Analytisk prøvetaking i begge beskrevne metoder er praktisk automatisert, noe som sikrer høy reproduserbarhet. Videre kan det forventes jevne analytiske løp så lenge riktig instrumenthåndteringspraksis og vedlikehold overholdes. Ved bruk av disse verktøyene for å analysere CFME-reaksjoner, bør det tas mer kritiske hensyn oppstrøms og nedstrøms prøvetaking. Under prøveforberedelsene er det viktig at tidskurskontrollene er representative for tids-null. Her ble proteiner utfelt i lysater ved forsuring for å stoppe metabolske reaksjoner. For tids-null-prøver ble syreløsningsmidlet kombinert med lysat før tilsetning av reaksjonsblandingen som inneholder glukose. Forsuring med trichloroacetic acid sørget effektivt for at glukose ikke metaboliseres ved tids-null, som vist i HPLC-RID-dataene (Figur 2). Mens en lignende prosedyre for å slukke glukosemetabolismen ble utført i den rapporterte LC-MS /MS-analysen, ble 13C-merkede metabolitter påvist i tids-null-prøver, om enn ved betydelig lave overflodsverdier i forhold til prøver ekstrahert på senere tidspunkter. Videre var disse observasjonene begrenset til mellomprodukter av glykolyse. Dataene tyder på at reaksjonene beholder en viss grad av glykolytisk aktivitet etter forsuring med ekstraksjonsløsningsmidlet som oppdages ved denne svært følsomme metoden. Omfanget av denne aktiviteten bør imidlertid kvantifiseres. En tidligere studie rapporterte at sure ekstraksjonsløsningsmidler kanskje ikke tilstrekkelig slukker mellomliggende glykolytiske reaksjoner, men kan stoppe betydelig glukoseforbruk10. Selv om dette gjenstår å undersøke nærmere i systemet som brukes her, kan drastiske endringer i relative overflodsverdier mellom tids-null og senere tidspunktprøver tolkes som trender i glukosemetabolismen. Utforske alternative slukkingsmetoder, men anbefales i lignende applikasjoner, spesielt for å oppnå absolutte mengder metabolske mellomprodukter10. Videre bør god praksis under nedstrøms programvareanalyser også observeres. Konsistens er viktig når du manuelt integrerer toppområder fra RID-signaler for å redusere menneskelig feil. Manuell integrasjon bør også brukes på toppområder av standarder når manuelt integrerte toppområder brukes til å kvantifisere metabolittkonsentrasjoner i prøver. Gjennom den målrettede LC-MS/MS-analysen bør foreløpige merknader fra MZmine-analysen valideres ved manuell toppkontroll ved hjelp av en MS-kvalitetsleser, og m/z-funksjoner bør bare kommenteres når beregnede massefeil er akseptable. Her ble disse analysene utført manuelt for et begrenset sett med mål siden omfattende og robust programvare for isotopsøk ennå ikke er etablert. Imidlertid er slike automatiserte metoder for å søke 13C-merkede metabolitter for tiden fremvoksende og vil effektivisere mer kompliserte analyser også, som profilering av lysater utover sentralkarbonmetabolisme25.
Avansert væskekromatografi er en robust og mye anvendt metode for å skille små molekyler i komplekse metabolske blandinger11. De beskrevne metodene kombinerer denne separasjonsteknikken med brytningsindeksen eller massespektrometrisk deteksjon for å analysere metabolittkonverteringer i lysatebaserte CFME-reaksjoner. HPLC-RID og LC-MS/MS er individuelt kraftige verktøy for profilering av aktiv lysatmetabolisme, og deres komplementaritet kan videre utnyttes for å adressere hver teknikks iboende begrensninger. De rapporterte metodene muliggjør anvendelse og utvikling av CFME som de kan brukes til å forstå lysate metabolisme, overvåke forbedringer i målrettede metabolitt konverteringer, og belyse endringer til metabolitt flux når manipulere lysat metabolisme.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble sponset av Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del av Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory administreres av UT-Battelle, LLC, for det amerikanske energidepartementet under kontrakt DE-AC05-00OR22725. Dette manuskriptet er skrevet av UT-Battelle, LLC under Contract DE-AC05- 00OR22725 med det amerikanske energidepartementet. Den amerikanske regjeringen beholder og utgiveren, ved å godta artikkelen for publisering, erkjenner at den amerikanske regjeringen beholder en ikke-eksklusiv, betalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere den publiserte formen for dette manuskriptet, eller la andre gjøre det, for amerikanske regjeringsformål. Institutt for energi vil gi offentlig tilgang til disse resultatene av føderalt sponset forskning i samsvar med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |