Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Summary

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

En los últimos años, se ha hecho evidente que los ribosomas no solo decodifican nuestro ARNm, sino que también guían la aparición de la cadena polipeptídica en el entorno celular abarrotado. Los ribosomas proporcionan la plataforma para la unión controlada espacial y cinéticamente de factores dirigidos a la membrana, enzimas modificadoras y chaperonas plegables. Incluso el ensamblaje en complejos oligoméricos de alto orden, así como los pasos de formación de la red proteína-proteína, se descubrieron recientemente que estaban coordinados con la síntesis.

Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método desarrollado para capturar interacciones co-traslacionales in vivo. Detallaremos los diversos pasos de purificación de afinidad necesarios para capturar complejos de cadena ribosómica-naciente junto con interactores co-traduccionales, así como la extracción de ARNm, la exclusión de tamaño, la transcripción inversa, la secuenciación profunda y los pasos de análisis de big data, necesarios para descifrar las interacciones co-traduccionales en resolución cercana al codón.

Introduction

Elrofiling Ribosome P(SeRP) es el único método, hasta la fecha, que captura y caracteriza las interacciones co-traslacionales, in vivo, de manera directa 1,2,3,4,5,6. SeRP permite el perfil global de las interacciones de cualquier factor con la traducción de ribosomas en resolución de codón cercano ^2,7.

El método se basa en la congelación instantánea de las células en crecimiento y la preservación de la traducción activa. Los lisados celulares se tratan con RNasa I para digerir todo el ARNm en la célula, excepto los fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas denominados “huellas de ribosomas”. La muestra se divide entonces en dos partes; una parte se utiliza directamente para el aislamiento de todas las huellas ribosómicas celulares, que representan toda la traducción en curso en la célula. La segunda parte se utiliza para la afinidad-purificación del subconjunto específico de ribosomas asociados con un factor de interés, por ejemplo: enzimas modificadoras, factores de translocación, chaperonas plegables e interacciones complejo-ensamblaje. Las huellas ribosómicas purificadas por afinidad se denominan colectivamente el interactoma. Luego, los ARNm protegidos por ribosomas se extraen y se utilizan para la generación de bibliotecas de ADNc, seguidos de una secuenciación profunda.

El análisis comparativo de las muestras totales de translatoma e interactoma permite la identificación de todos los orfs que se asocian con el factor de interés, así como la caracterización de cada perfil de interacción orf. Este perfil informa las secuencias precisas de inicio y terminación del compromiso a partir de las cuales se pueden inferir los codones decodificados y los residuos respectivos de la cadena polipeptídica emergente, así como sobre las variaciones de velocidad del ribosoma durante la interacción ^7,8. La figura 1 muestra el protocolo como un esquema.

Figura 1: Una visión general del protocolo SeRP. Este protocolo se puede realizar en su totalidad en un plazo de 7-10 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Generación de cepas para el perfil selectivo de ribosomas NOTA: Elrofiling Ribosome P(SeRP) es un método que se basa en la purificación por afinidad de factores de interés, para evaluar su modo de interacción con complejos de cadena ribosomas-nacientes. La recombinación homóloga9, así como los métodos basados en CRISPR / Cas910 se utilizan para fusionar varios factores de interés con etiquetas para purificaciones d…

Representative Results

Como se ilustra en el diagrama de flujo de este protocolo (Figura 1), las células se cultivaron hasta la fase de registro, y luego se recolectaron rápidamente por filtración y se lisaron mediante molienda criogénica. El lisado se dividió en dos: uno para las huellas totales de ARNm protegido por ribosomas y el otro para las huellas de ARNm protegidas por ribosomas seleccionadas, en las que realizamos la purificación de afinidad para reducir los complejos de cadenas nacientes proteína-…

Discussion

Aquí, el protocolo detalla el enfoque de perfil selectivo de ribosomas para capturar interacciones co-traduccionales en resolución cercana al codón. A medida que el ribosoma se eleva como un centro para coordinar la aparición de la cadena naciente en el citoplasma abarrotado, este es un método crucial para identificar y caracterizar las diversas interacciones co-traduccionales necesarias para garantizar un proteoma funcional, así como para estudiar diversas enfermedades. Hasta la fecha, SeRP es el único método q…

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705