Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

Summary

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l’analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Negli ultimi anni, è diventato evidente che i ribosomi non solo decodificano il nostro mRNA, ma guidano anche l’emergere della catena polipeptidica nell’ambiente cellulare affollato. I ribosomi forniscono la piattaforma per il legame controllato spazialmente e cineticamente di fattori di targeting della membrana, enzimi modificanti e chaperoni pieghevoli. Anche l’assemblaggio in complessi oligomerici di alto ordine, così come le fasi di formazione della rete proteina-proteina, sono stati recentemente scoperti per essere coordinati con la sintesi.

Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo sviluppato per catturare le interazioni co-traduzionali in vivo. Descriveremo in dettaglio le varie fasi di purificazione dell’affinità necessarie per catturare complessi ribosomi-catena nascente insieme agli interattori co-traduzionali, nonché l’estrazione dell’mRNA, l’esclusione delle dimensioni, la trascrizione inversa, il sequenziamento profondo e le fasi di analisi dei big data, necessarie per decifrare le interazioni co-traduzionali nella risoluzione quasi codone.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) è l’unico metodo, ad oggi, che cattura e caratterizza le interazioni co-traslazionali, in vivo, in modo diretto ^1,2,3,4,5,6. SeRP consente la profilazione globale delle interazioni di qualsiasi fattore con la traduzione dei ribosomi nella risoluzione vicino al codone ^2,7.

Il metodo si basa sul congelamento flash delle cellule in crescita e sulla conservazione della traduzione attiva. I lisati cellulari vengono quindi trattati con RNasi I per digerire tutto l’mRNA nella cellula ad eccezione dei frammenti di mRNA protetti dai ribosomi chiamati “impronte di ribosomi”. Il campione viene quindi diviso in due parti; una parte viene utilizzata direttamente per l’isolamento di tutte le impronte ribosomiali cellulari, rappresentando tutta la traduzione in corso nella cellula. La seconda parte viene utilizzata per l’affinità-purificazione del sottoinsieme specifico di ribosomi associati a un fattore di interesse, ad esempio: modifica di enzimi, fattori di traslocazione, chaperoni di piegatura e interazioni complesso-assemblaggio. Le impronte ribosomiali purificate dall’affinità sono collettivamente chiamate interattoma. Quindi, gli mRNA protetti dai ribosomi vengono estratti e utilizzati per la generazione di librerie di cDNA, seguiti dal sequenziamento profondo.

L’analisi comparativa dei campioni totali di translatome e interactome consente l’identificazione di tutti gli orfs che si associano al fattore di interesse, nonché la caratterizzazione di ciascun profilo di interazione orf. Questo profilo riporta le precise sequenze di insorgenza e terminazione dell’incarico da cui si possono dedurre i codoni decodificati e i rispettivi residui della catena polipeptidica emergente, nonché sulle variazioni di velocità del ribosoma durante l’interazione ^7,8. La Figura 1 illustra il protocollo come schematico.

Figura 1: Panoramica del protocollo SeRP. Questo protocollo può essere eseguito nella sua interezza entro 7-10 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Generazione di ceppi per la profilazione selettiva dei ribosomi NOTA: Selective Ribosome Profiling (SeRP) è un metodo che si basa sulla purificazione dell’affinità dei fattori di interesse, per valutare la loro modalità di interazione con i complessi di catene ribosomi-nascenti. La ricombinazione omologa9 e i metodi basati su CRISPR / Cas910 vengono utilizzati per fondere vari fattori di interesse con tag per purificazion…

Representative Results

Come illustrato nel diagramma di flusso di questo protocollo (Figura 1), le cellule sono state coltivate fino alla fase di log, e poi raccolte rapidamente per filtrazione e lisate mediante macinazione criogenica. Il lisato è stato poi diviso in due: uno per le impronte totali di mRNA protette dai ribosomi e l’altro per impronte di mRNA protette da ribosomi selezionate, su cui abbiamo eseguito la purificazione dell’affinità per abbattere i complessi di catene proteiche-ribosomi-nascenti mar…

Discussion

Qui, il protocollo descrive in dettaglio l’approccio Selective Ribosome Profiling per l’acquisizione di interazioni co-traslazionali in risoluzione quasi codone. Mentre il ribosoma sale come hub per coordinare l’emergenza della catena nascente nel citoplasma affollato, questo è un metodo cruciale per identificare e caratterizzare le varie interazioni co-traduzionali necessarie per garantire un proteoma funzionale, nonché per studiare varie malattie. Ad oggi, la SeRP è l’unico metodo in grado di catturare e caratteriz…

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705