प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों-संवेदनशील फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करके मुरीन आंतों के ऑर्गेनोइड्स में ऑक्सीडेटिव तनाव का विश्लेषण करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल गुणात्मक इमेजिंग और मात्रात्मक साइटोमेट्री एसेस का उपयोग करके आंतों के म्यूरीन ऑर्गेनोइड्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस काम को संभावित रूप से आरओएस पर चयनित यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अन्य फ्लोरोसेंट जांच तक बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) आंतों के होमियोस्टैसिस में आवश्यक भूमिका निभाती हैं। ROS सेल चयापचय के प्राकृतिक उप-उत्पाद हैं। वे म्यूकोसल स्तर पर संक्रमण या चोट के जवाब में उत्पादित होते हैं क्योंकि वे रोगाणुरोधी प्रतिक्रियाओं और घाव भरने में शामिल होते हैं। वे महत्वपूर्ण माध्यमिक दूत भी हैं, जो सेल विकास और भेदभाव सहित कई मार्गों को विनियमित करते हैं। दूसरी ओर, अत्यधिक आरओएस स्तर ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है, जो कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है और पुरानी सूजन या कैंसर जैसी आंतों की बीमारियों का पक्ष ले सकता है। यह काम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करके लाइव इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा आंतों के म्यूरीन ऑर्गेनोइड्स में आरओएस का पता लगाने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है। यहां प्रोटोकॉल यौगिकों के प्रभाव का वर्णन करता है जो आंतों के ऑर्गेनोइड्स में रेडॉक्स संतुलन को संशोधित करते हैं और विशिष्ट आंतों के सेल प्रकारों में आरओएस के स्तर का पता लगाते हैं, यहां जीएफपी के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए आंतों के स्टेम कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा उदाहरण दिया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट जांच के साथ किया जा सकता है।
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) सेलुलर चयापचय के प्राकृतिक उप-उत्पाद हैं। उन्हें झिल्ली-बाध्य NADPH-Oxidases (NOX) और दोहरी ऑक्सीडेज (DUOX) जैसे विशेष एंजाइमेटिक परिसरों द्वारा भी सक्रिय रूप से उत्पादित किया जा सकता है, जो सुपरऑक्साइड अनियन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड 1 उत्पन्न करते हैं। एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों और आरओएस स्कैवेंजर्स को व्यक्त करके, कोशिकाएं अपने रेडॉक्स संतुलन को बारीक ढंग से ट्यून कर सकती हैं, जिससे ऊतक होमियोस्टैसिस 2 की रक्षा हो सकती है। हालांकि आरओएस कोशिकाओं के लिए अत्यधिक विषाक्त हो सकता है और डीएनए, प्रोटीन और लिपिड को नुकसान पहुंचा सकता है, वे महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु हैं2। आंतों के उपकला में, स्टेम और पूर्वज सेल प्रसार के लिए मध्यम आरओएस स्तर की आवश्यकता होती है3; उच्च ROS स्तर उनके apoptosis4 के लिए नेतृत्व करते हैं। क्रोनिक ऑक्सीडेटिव तनाव कई जठरांत्र संबंधी बीमारियों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि सूजन आंत्र रोग या कैंसर। एक उदाहरण के रूप में, WNT-संचालित आंतों के कैंसर के माउस मॉडल में, NADPH-oxidases के सक्रियण के माध्यम से ऊंचा ROS उत्पादन कैंसर कोशिकाओं hyperproliferation5,6 के लिए आवश्यक पाया गया था। यह परिभाषित करना कि आंतों की कोशिकाएं, विशेष रूप से स्टेम कोशिकाओं में, स्टेम कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव तनाव का प्रबंधन कैसे करती हैं और सेलुलर वातावरण इस क्षमता को कैसे प्रभावित कर सकता है, इस बीमारी के एटियलजि को बेहतर ढंग से समझने के लिए आवश्यक है।
एक ऊतक में, विभिन्न सेल प्रकार एक बेसल ऑक्सीडेटिव राज्य पेश करते हैं जो उनके कार्य और चयापचय और ऑक्सीडेंट और एंटीऑक्सिडेंट अणुओं के विभिन्न स्तरों की अभिव्यक्ति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं4,7। वीवो में आरओएस की निगरानी बहुत चुनौतीपूर्ण है। सेल पारगम्य रंजक जो उनके रेडॉक्स राज्य के अनुसार प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं, उन्हें जीवित कोशिकाओं और जानवरों में सेलुलर आरओएस की कल्पना और मापने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, उनकी प्रभावकारिता जीवित ऊतकों के अंदर उनके प्रसार और उनके तेजी से रीडआउट पर निर्भर करती है, जिससे उन्हें पशु मॉडल 8 में उपयोग करना मुश्किल हो जाता है।
अतीत में, आरओएस पीढ़ी पर यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन सेल लाइनों का उपयोग करके किया गया था, लेकिन यह इन विवो स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है। आंतों organoid मॉडल, Clevers9 के समूह द्वारा विकसित, आंतों की प्राथमिक कोशिकाओं पूर्व vivo के विकास में सक्षम बनाता है। आव्यूहों में आंतों के क्रिप्ट्स की संस्कृति, परिभाषित विकास कारकों की उपस्थिति में, तीन आयामी संरचनाओं की ओर ले जाती है, जिन्हें ऑर्गेनोइड्स (मिनी-आंत) कहा जाता है, जो क्रिप्ट-विलस संगठन को पुन: पेश करते हैं, जिसमें विभिन्न उपकला वंशों से कोशिकाएं एक आंतरिक लुमेन को अस्तर करती हैं, और आंतों की स्टेम कोशिकाएं छोटे क्रिप्ट्स-जैसे प्रोट्रूशन में रहती हैं।
यहां, इस मॉडल का लाभ उठाते हुए, ऑर्गेनोइड संस्कृति माध्यम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरओएस-संवेदनशील डाई जोड़कर एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर प्राथमिक आंतों की कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया गया है।
प्लेट पाठकों का उपयोग अक्सर कुल आबादी में आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry या इमेजिंग परख आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं या विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला के साथ एक विशेष सेल प्रकार में आरओएस का पता लगाने के लिए उपयोग करता है। इस काम में माउस आंत्र ऑर्गेनोइड संस्कृति और आरओएस विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है कॉन्फोकल इमेजिंग और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिमाणीकरण। Lgr5-GFP चूहों-व्युत्पन्न छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके, विभिन्न उपचारों पर आंतों की स्टेम कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर का विशेष रूप से विश्लेषण करना संभव है। इस प्रोटोकॉल को एक्सोजेनस अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न म्यूरिल-डाइपेप्टाइड (एमडीपी) 10, आरओएस संतुलन पर, चयनित यौगिकों के साथ ऑर्गेनोइड्स को उत्तेजित करने के बाद।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम मुरीन जेजुनल क्रिप्ट्स को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, उन्हें 3 डी ऑर्गेनोइड्स में संस्कृति करता है, और ऑर्गेनोइड्स में आरओएस का विश्लेषण करता है, पूरे ऑर्गेनोइड्स के ग?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) अनुदान 17-CE14-0022 (i-Stress) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
Riferimenti
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
