Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives de l’oxygène
Summary
Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.
Abstract
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie intestinale. Les ROS sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils sont produits en réponse à une infection ou à une blessure au niveau de la muqueuse car ils sont impliqués dans les réponses antimicrobiennes et la cicatrisation des plaies. Ils sont également des messagers secondaires essentiels, régulant plusieurs voies, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. D’autre part, des niveaux excessifs de ROS conduisent à un stress oxydatif, qui peut être délétère pour les cellules et favoriser les maladies intestinales comme l’inflammation chronique ou le cancer. Ce travail fournit une méthode simple pour détecter les ROS dans les organoïdes murins intestinaux par imagerie en direct et cytométrie en flux, à l’aide d’une sonde fluorogénique disponible dans le commerce. Ici, le protocole décrit le dosage de l’effet des composés qui modulent l’équilibre redox dans les organoïdes intestinaux et détectent les niveaux de ROS dans des types de cellules intestinales spécifiques, illustré ici par l’analyse des cellules souches intestinales génétiquement marquées avec GFP. Ce protocole peut être utilisé avec d’autres sondes fluorescentes.
Introduction
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils peuvent également être produits activement par des complexes enzymatiques spécialisés tels que les NADPH-oxydases (NOX) et les oxydases doubles (DUOX) liées à la membrane, qui génèrent des anions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène1. En exprimant des enzymes antioxydantes et des piégeurs de ROS, les cellules peuvent ajuster finement leur équilibre redox, protégeant ainsi l’homéostasie tissulaire2. Bien que les ROS puissent être très toxiques pour les cellules et endommager l’ADN, les protéines et les lipides, ce sont des molécules de signalisation cruciales2. Dans l’épithélium intestinal, des taux modérés de ROS sont nécessaires pour la prolifération des cellules souches et progénitrices3; des niveaux élevés de ROS conduisent à leur apoptose4. Le stress oxydatif chronique est lié à de nombreuses maladies gastro-intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer. À titre d’exemple, dans un modèle murin de cancer intestinal induit par Wnt, une production élevée de ROS par activation des NADPH-oxydases s’est avérée nécessaire pour l’hyperprolifération des cellules cancéreuses5,6. Définir comment les cellules intestinales, en particulier les cellules souches, les cellules souches gèrent le stress oxydatif et comment l’environnement cellulaire peut avoir un impact sur cette capacité est essentiel pour mieux comprendre l’étiologie de cette maladie7.
Dans un tissu, différents types de cellules présentent un état oxydatif basal qui peut varier en fonction de leur fonction et de leur métabolisme et de l’expression de différents niveaux de molécules oxydantes et antioxydantes4,7. La surveillance des ROS in vivo est très difficile. Des colorants perméables cellulaires qui émettent de la fluorescence en fonction de leur état redox ont été développés pour visualiser et mesurer les ROS cellulaires dans les cellules vivantes et les animaux. Cependant, leur efficacité dépend de leur diffusion à l’intérieur des tissus vivants et de leur lecture rapide, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les modèles animaux8.
Dans le passé, l’étude de l’effet des composés sur la génération de ROS a été réalisée à l’aide de lignées cellulaires, mais cela peut ne pas refléter la situation in vivo . Le modèle organoïde intestinal, développé par le groupe clevers9, permet la croissance des cellules primaires intestinales ex vivo. La culture de cryptes intestinales dans des matrices, en présence de facteurs de croissance définis, conduit à des structures tridimensionnelles, appelées organoïdes (mini-intestin), qui reproduisent l’organisation crypte-villosité, avec des cellules des différentes lignées épithéliales tapissant une lumière interne, et les cellules souches intestinales résidant dans de petites protubérances ressemblant à des cryptes.
Ici, en tirant parti de ce modèle, une méthode simple est décrite pour étudier le stress oxydatif dans les cellules intestinales primaires à la résolution unicellulaire en ajoutant un colorant sensible aux ROS disponible dans le commerce dans le milieu de culture organoïde.
Les lecteurs de plaques sont souvent utilisés pour détecter la production de ROS dans une population totale. Ce protocole utilise la cytométrie en flux ou le test d’imagerie pour détecter les ROS dans un type cellulaire particulier avec des cellules génétiquement modifiées ou une coloration d’anticorps spécifique. Ce travail implique la culture d’organoïdes intestinaux de souris et la visualisation des ROS par imagerie confocale et quantification par cytométrie en flux. En utilisant des organoïdes de l’intestin grêle dérivés de souris Lgr5-GFP, il est possible d’analyser spécifiquement le niveau de stress oxydatif dans les cellules souches intestinales lors de différents traitements. Ce protocole peut être adapté pour tester l’influence de molécules exogènes, telles que le muramyl-dipeptide (MDP)10 dérivé du microbiote, sur l’équilibre ROS, après avoir stimulé les organoïdes avec les composés sélectionnés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail fournit un protocole étape par étape pour isoler les cryptes jéjunales murines, les cultiver en organoïdes 3D et analyser les ROS dans les organoïdes en combinant une sonde fluorogénique sensible aux ROS avec une imagerie microscopique qualitative des organoïdes entiers et une mesure quantitative des ROS en utilisant la cytométrie en flux sur des cellules individuelles après la dissociation organoïde.
La première étape critique de cette méthode est la procédure d’ext…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Français subvention 17-CE14-0022 (i-Stress) de l’Agence nationale de la recherche (ANR).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
Riferimenti
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