Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell’ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l’imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l’effetto di composti selezionati sui ROS.
Abstract
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) svolgono un ruolo essenziale nell’omeostasi intestinale. I ROS sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Sono prodotti in risposta a infezioni o lesioni a livello mucoso in quanto sono coinvolti nelle risposte antimicrobiche e nella guarigione delle ferite. Sono anche messaggeri secondari critici, che regolano diversi percorsi, tra cui la crescita e la differenziazione cellulare. D’altra parte, livelli eccessivi di ROS portano a stress ossidativo, che può essere deleterio per le cellule e favorire malattie intestinali come l’infiammazione cronica o il cancro. Questo lavoro fornisce un metodo semplice per rilevare i ROS negli organoidi murini intestinali mediante imaging dal vivo e citometria a flusso, utilizzando una sonda fluorogenica disponibile in commercio. Qui il protocollo descrive l’analisi dell’effetto di composti che modulano l’equilibrio redox negli organoidi intestinali e rilevano i livelli di ROS in specifici tipi di cellule intestinali, esemplificato qui dall’analisi delle cellule staminali intestinali geneticamente etichettate con GFP. Questo protocollo può essere utilizzato con altre sonde fluorescenti.
Introduction
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Possono anche essere prodotti attivamente da complessi enzimatici specializzati come le NADPH-ossidasi legate alla membrana (NOX) e le dual ossidasi (DUOX), che generano anione superossido e perossido di idrogeno1. Esprimendo enzimi antiossidanti e spazzini ROS, le cellule possono sintonizzare finemente il loro equilibrio redox, proteggendo così l’omeostasi dei tessuti2. Sebbene i ROS possano essere altamente tossici per le cellule e danneggiare il DNA, le proteine e i lipidi, sono molecole di segnalazione cruciali2. Nell’epitelio intestinale sono necessari livelli moderati di ROS per la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici3; alti livelli di ROS portano alla loro apoptosi4. Lo stress ossidativo cronico è legato a molte malattie gastrointestinali, come le malattie infiammatorie intestinali o il cancro. Ad esempio, in un modello murino di cancro intestinale guidato da Wnt, è risultata necessaria un’elevata produzione di ROS attraverso l’attivazione di NADPH-ossidasi per l’iperproliferazione delle cellule tumorali5,6. Definire come le cellule intestinali, in particolare le cellule staminali, gestiscono lo stress ossidativo e come l’ambiente cellulare può influire su questa capacità è essenziale per comprendere meglio l’eziologia di questa malattia7.
In un tessuto, diversi tipi di cellule presentano uno stato ossidativo basale che può variare in base alla loro funzione e al loro metabolismo e all’espressione di diversi livelli di molecole ossidanti e antiossidanti4,7. Il monitoraggio dei ROS in vivo è molto impegnativo. I coloranti permeabili alle cellule che emettono fluorescenza in base al loro stato redox sono stati sviluppati per visualizzare e misurare i ROS cellulari nelle cellule viventi e negli animali. Tuttavia, la loro efficacia dipende dalla loro diffusione all’interno dei tessuti viventi e dalla loro rapida lettura, rendendoli difficili da usare nei modelli animali8.
In passato, lo studio dell’effetto dei composti sulla generazione di ROS è stato fatto utilizzando linee cellulari, ma questo potrebbe non riflettere la situazione in vivo . Il modello organoide intestinale, sviluppato dal gruppo di Clevers9, consente la crescita di cellule primarie intestinali ex vivo. La coltura di cripte intestinali in matrici, in presenza di fattori di crescita definiti, porta a strutture tridimensionali, chiamate organoidi (mini-intestino), che riproducono l’organizzazione cripto-villi, con cellule delle diverse linee epiteliali che rivestono un lume interno e le cellule staminali intestinali che risiedono in piccole sporgenze simili a cripte.
Qui, sfruttando questo modello, viene descritto un metodo semplice per studiare lo stress ossidativo nelle cellule intestinali primarie alla risoluzione di una singola cellula aggiungendo un colorante ros-sensibile disponibile in commercio nel terreno di coltura organoide.
I lettori di lastre sono spesso utilizzati per rilevare la produzione di ROS in una popolazione totale. Questo protocollo utilizza la citometria a flusso o il test di imaging per rilevare ROS in un particolare tipo di cellula con cellule geneticamente modificate o colorazione anticorpale specifica. Questo lavoro coinvolge la coltura di organoidi intestinali di topo e la visualizzazione ROS mediante imaging confocale e quantificazione mediante citometria a flusso. Utilizzando gli organoidi dell’intestino tenue derivati da topi Lgr5-GFP, è possibile analizzare in modo specifico il livello di stress ossidativo nelle cellule staminali intestinali con diversi trattamenti. Questo protocollo può essere adattato per testare l’influenza di molecole esogene, come il muramil-dipeptide derivato dal microbiota (MDP)10, sul bilancio ROS, dopo aver stimolato gli organoidi con i composti selezionati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro fornisce un protocollo passo-passo per isolare le cripte digiunali murine, coltivarle in organoidi 3D e analizzare i ROS negli organoidi combinando una sonda fluorogenica sensibile ai ROS con l’imaging al microscopio qualitativo di organidi interi e la misurazione quantitativa dei ROS utilizzando la citometria a flusso su singole cellule dopo la dissociazione organoide.
Il primo passo critico in questo metodo è la procedura di estrazione delle cripte. In effetti, la qualità del…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 17-CE14-0022 (i-Stress) dell’Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
Riferimenti
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