Här presenterar vi en pipeline för 3D-korrelativ fokuserad jonstrålefräsning för att vägleda beredningen av cellulära prover för kryoelektrontomografi. 3D-positionen för fluorescerande märkta proteiner av intresse bestäms först med kryofluorescensmikroskopi och riktas sedan mot malning. Protokollet är lämpligt för däggdjurs-, jäst- och bakterieceller.
Kryoelektrontomografi (kryo-ET) har blivit den bästa metoden för att undersöka cellulära ultrastrukturer och molekylära komplex i deras ursprungliga, frusna hydratiserade tillstånd. Kryo-ET kräver dock att proverna är tillräckligt tunna för att inte sprida eller blockera den infallande elektronstrålen. För tjocka cellprover kan detta uppnås genom kryofokuserad jonstrålefräsning (FIB). Detta protokoll beskriver hur man riktar in sig på specifika cellulära platser under FIB-fräsning med hjälp av en 3D-korrelativ metod, som kombinerar tredimensionella fluorescensmikroskopidata med information från FIB-svepelektronmikroskopet. Med hjälp av denna teknik kan sällsynta cellulära händelser och strukturer riktas med hög noggrannhet och visualiseras med molekylär upplösning med hjälp av kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM).
Fokuserad jonstrålefräsning gör det möjligt att framställa tunna biologiska prover från kryofixerade prover utan de problem som vanligtvis förknippas med mekaniska snittar som knivmärken och kompressionsartefakter1. I kombination med kryoelektrontomografi möjliggör FIB-fräsning högupplösta biologiska studier av cellulär morfologi och bestämning av strukturen hos makromolekylära komplex direkt inifrån celler med subnanometerupplösning 2,3,4. Medan rikliga arter, såsom ribosomer, lätt hittas i slumpmässigt skurna FIB-lameller, är många cellulära processer beroende av samlokalisering av flera komplex eller är lokaliserade till specifika platser i cellen. Följaktligen krävs effektiv målinriktning för att inte förlora den biologiska egenskapen av intresse under malningsprocessen och begränsas till slumpmässiga träffar. Ett korrelerat tillvägagångssätt som kombinerar data från svepelektronmikroskopet (SEM)-FIB och ett kryofluorescensljusmikroskop (FLM) är därför nödvändigt. Även om det är möjligt att utelämna den initiala korrelationen och kombinera FLM- och cryo-ET-data först efter TEM-insamling5,6, möjliggör fluorescensstyrd fokuserad jonstrålefräsning ett exakt val av fräsområdet i förväg, vilket resulterar i effektivare datainsamling. Sedan dess idé7 har tillämpningen av 3D-korrelerad FIB-fräsning i biologiska studier varit begränsad tills vi nyligen rapporterade att vi identifierat ett nytt vätske-vätskefasseparerat (LLPS) fack i jäst med hjälp av denna teknik8.
Här beskrivs ett generaliserat 3D-kryokorrelerat ljus- och elektronmikroskopiprotokoll (CLEM), som kan användas för att studera ett brett utbud av prover, allt från bakterier till jäst- och däggdjursceller. Även om experimenten utfördes med en viss uppsättning instrument, är de enskilda stegen inte bundna till specifik hårdvara och kan enkelt överföras till andra system som en förlängning av befintliga protokoll 3,5. En lista över testad utrustning och föreslagna inställningar finns i materialtabellen och tabell 1. De fyra nyckelstegen i pipelinen är (1) provberedning, (2) lokalisering av intressanta egenskaper genom kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korrelerad fokuserad jonstrålefräsning och (4) lokalisering av de riktade strukturerna för kryo-ET-datainsamling på lamellerna i kryotransmissionselektronmikroskopet (figur 1).
1. Kritiska steg i protokollet
Optimering av cellodling och rutnätsdoppningsparametrar är grundläggande för detta arbetsflöde. I början av ett projekt är det värt att investera tid för att optimera märkningsstrategier, fördelningen av celler och fiduciella pärlor och testa olika rutnätsberednings- och blottningsparametrar. Att arbeta med ett optimalt djupfryst prov kommer att underlätta bearbetningen nedströms avsevärt.
Som för alla TEM-experiment krävs glaskroppsprover. För stora däggdjursceller som HeLa är 1-2 celler per rutnätsruta att föredra, men cellerna kan fortfarande vara glasaktiga vid högre densitet. Alternativt kan vitrifiering förbättras i däggdjursceller (t.ex. HEK293, HeLa) genom att inkubera dem med 2,5-10 % (v/v) glycerol tillsatt till odlingsmediet 10 minuter före nedsänkning23. Om det finns tillgängligt kan rutnätsmönster användas för att säkerställa perfekt placering och fördelning av cellerna, vilket förbättrar vitrifiering och senare korrelation24.
Specifika celler kan väljas under arbetsflödet, men för få celler som visar den biologiska funktionen av intresse kommer att minska det totala dataflödet avsevärt. För att förbättra korrelationen i POI-positiva celler bör tillräckligt ljusa fluoroforer användas. Detta är särskilt viktigt vid endogena uttrycksnivåer. Vi fann att mVenus under kryoförhållanden ofta presterade bättre än EGFP på grund av dess ökade ljusstyrka25 och den hypsokroma förskjutningen, vilket gör den lämplig för vanliga GFP-filteruppsättningar under kryoförhållanden26. För icke-punktliknande målstrukturer bör avvägningen mellan våglängd och lokaliseringsnoggrannhet (Abbe-diffraktionsgräns) också övervägas.
Effektiv 3D-korrelation kräver också att näten är mekaniskt stabila och hanteras med stor försiktighet. Medan vanliga guld- eller kopparnät med kolstöd kan användas, kan framgångsgraden ökas avsevärt genom att använda styvare SiO2-filmer beroende på projektet. Det har dock ännu inte slutgiltigt fastställts om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchande termiska expansionskoefficienter (substrat kontra film) för att minska kryoskrynkling27, är den mest avgörande faktorn för framgångsrik 3D-korrelation. Dessutom, för att plocka upp ömtåliga Au-galler, kan polydimetylsiloxanbelagda skålar användas5.
Förutom att säkerställa provstabiliteten är ett noggrant val av FLM-avbildningsparametrar nödvändigt för att erhålla fluorescensstackar av hög kvalitet som är lämpliga för optimal inriktning under FIB-fräsning. I detta avseende rekommenderas också att testa olika denoising28 – eller deconvolution-tekniker på FLM-data, eftersom det avsevärt kan förbättra lokaliseringen av fiduciala och cellulära signaler. När man korrelerar fluorescenssignalen till FIB-SEM-bilder är det viktigt med ett bra urval av fiduciella pärlor. De ska vara väl fördelade runt cellerna och eventuellt på olika z-höjder. Det är också god praxis att validera korrelationens konsistens genom att kontrollera de förutsagda kontra faktiska positionerna för pärlor som avsiktligt utelämnades från den fiduciella modellen men som tydligt kan korreleras med ögat. 3DCT:s RMSE-värden bör också alltid beaktas för att kontrollera registreringskonsistensen.
Eftersom deponeringen av malet material och restvatten från FIB-SEM-kammaren (dvs. återkontaminering) ökar den effektiva lamelltjockleken genom att tillsätta amorft material på båda sidor av den, minskar finmalda lameller i mikroskopet under en längre tid i allmänhet TEM-datakvaliteten på grund av ytterligare elektronspridningshändelser. Följaktligen utförs fräsning oftast i två steg: först fräses alla positioner grovt (dvs. till cirka 800 nm) och sedan fint (till ~150-250 nm), och gallret lossas omedelbart efter att den sista lamellen har slutförts. Bättre korrelationsframgång kan dock uppnås genom att bearbeta de intressanta positionerna på ett platsvis sätt, och därmed utföra grov- och finfräsning på samma lamell direkt efter varandra eftersom detta inte lämnar någon tid för böjning eller deformation. Detta minskar dock det maximala antalet lameller som kan produceras per galler beroende på systemets återkontamineringshastighet. För en hastighet på 20 nm/h produceras 4-6 lameller inom 1-1,5 h.
Förflyttning av hela gallret eller de grovfrästa lamellerna >300 nm kommer att resultera i dålig eller misslyckad korrelation (se även begränsningar som diskuteras nedan). Den bör därför kontrolleras regelbundet, t.ex. genom att jämföra IB-bilder före, under och efter FIB-fräsning. Platser som visar betydande rörelse (>300 nm) bör kasseras. Optimera provberedningen (dvs. val av rutnätstyp, celldensitet och dykparametrar; se protokollavsnitt 1) och frässtrategi för att undvika dessa rörelser. Lamellböjning kan minskas avsevärt genom platsvis fräsning enligt beskrivningen i steg 3.6 och genom att minska lamellbredden. Som tidigare nämnts, även om spänningsavlastningsskärningar15 har utformats för att minska lamellböjning, resulterar de ofta i en samordnad rörelse av den frikopplade lamellen, vilket effektivt förhindrar korrelation. Integrerade FLM-system kan användas för att lösa detta problem.
2. Modifieringar och problem med metoden
Det rekommenderas starkt att utföra en grundlig karakterisering av provet i levande cellavbildning innan du går till kryoförhållanden. Att optimera cellproverna, behandlingsscheman och veta vilken typ av signal man kan förvänta sig innan man går in i kryoarbetsflödet kan avsevärt förbättra dess framgångsfrekvens.
I arbetsflödet som presenteras här används ett fristående fluorescensmikroskop med ett kryosteg för att avbilda proverna, följt av en överföring av rutnäten till det fokuserade jonstrålemikroskopet. Det har dock testats på system där ett fluorescensmikroskop är integrerat i FIB-SEM-kammaren, och därför krävs ingen provöverföring för att ta fluorescensbilder 29,30,31. Med hjälp av sådana integrerade system kan intressanta positioner avbildas under och efter FIB-fräsning för att kontrollera närvaron av målfluorescenssignalen utan att öka risken för kontaminering av de slutliga lamellerna. Det är dock viktigt att komma ihåg de optiska parametrarna för de använda mikroskopen, eftersom t.ex. ett lågt NA-objektiv kommer att begränsa precisionen med vilken fiduciella pärlor och målsignaler kan lokaliseras. Icke desto mindre kommer integrerade FLM-inställningar att hjälpa till att bättre hantera små deformationer av galler och lameller, eftersom FLM-stackar kontinuerligt kan uppdateras och jämföras med uppdaterade SEM- och IB-vyer.
Som ett alternativ till fluorescensavbildning av lamellerna mellan FIB-fräsning och TEM-datainsamling kan post-TEM-korrelation användas för att verifiera korrekt placering och fräsning av lamellerna 5,6.
Under alla steg i det korrelativa arbetsflödet, men särskilt under TEM, rekommenderas att du skapar en överlagring av projicerade fluorescensdata på FIB-SEM/TEM-bilderna. Sådana klassiska CLEM-vyer hjälper till att mer intuitivt förstå vilken del av cellerna som finns i lamellerna. Detta fungerar också som en användbar rimlighetskontroll för att verifiera korrelationens noggrannhet.
3. Metodens begränsningar
Den 3D-korrelativa FIB-metoden kräver prover som kan förses med fiduciella pärlor. Följaktligen är denna metod för närvarande begränsad till dykfrysta galler. För högtrycksfrysta (HPF) vävnadsprover, för närvarande, kan endast 2D-2D-korrelationer utföras. Potentiellt kan interna fiduciella markörer (t.ex. organeller, färgade lipiddroppar) vara en lösning på detta problem32,33. Den slutliga korrelationsframgångsfrekvensen beror på många faktorer, inklusive provkvaliteten, fluorescensmikroskopiinställningen, lamelltjockleken och storleken på den riktade strukturen. Korrelationsnoggrannheten med den beskrivna 3D-registreringsmetoden uppskattas till intervallet 200-300 nm på den slutliga IB-bilden, vilket ungefär motsvarar den typiska tjockleken på FIB-frästa lameller7. Följaktligen kommer cellulära strukturer som är mycket mindre än detta att vara svåra att rikta in sig på för närvarande. Dessutom minskar överdriven rörelse vid fräsplatsen (>300 nm) också noggrannheten i korrelationen, ett problem som potentiellt kan åtgärdas med FLM-inställningar integrerade i FIB/SEM-instrument. Lameller som uppvisar stark deformation eller böjning under fräsning bör i vilket fall som helst uteslutas från arbetsflödet nedströms.
Sammantaget är kryofluorescensavbildning för närvarande begränsad av Abbe-diffraktionskriteriet. Med mer rutinmässig tillämpning (och kommersialisering) av superupplösta kryo-FLM-metoder kan mer exakt inriktning av cellulära strukturer bli möjlig, särskilt när den integreras i FIB/SEM för drift i farten.
4. Metodens betydelse
Speciellt i jämförelse med icke-mål- och postkorrelationstekniker gör den 3D-korrelerade FIB-fräsningsmetoden det möjligt att välja lämpliga positioner före det tids- och resurskrävande TEM-steget. Det möjliggör därmed effektivare datainsamling och projektplanering. Dessutom lägger korrelerade fluorescensdata till ett lager av information som kan vara avgörande för att tolka tomogrammen och för att integrera kryo-ET-resultaten i flerskaliga projekt, särskilt när det handlar om icke-strukturerade proteinsammansättningar eller de som är för små för mallmatchning och subtomogrammedelvärde.
5. Betydelse och potentiella framtida tillämpningar
I kombination med avancerade arbetsflöden som kryolyft ur HPF-prover 34,35, kryo-FIB-SEM-volym 36 och superupplöst fluorescensavbildning26,37,38,39, erbjuder 3D-riktad lamellberedning möjligheten att inte bara dissekera biologiska processer i isolerade celler utan också att göra vävnads- och patientprover tillgängliga för FIB-fräsning och kryoelektrontomografi. Som sådan kommer det att möjliggöra dissektion av patologiska processer med hög upplösning och därmed vara en integrerad byggsten mot en biopsi på nanoskala.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Inga Wolf för stöd till IT-infrastrukturen, Florian Beck för beräkningsstöd och Oda H. Schiøtz för den kritiska läsningen av manuskriptet. Finansieringen tillhandahölls delvis genom ett Alexander von Humboldt-återvändarstipendium till Philipp S. Erdmann och ett EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 till Florian Wilfling. Anna Bieber fick stöd av ett Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. stipendium.
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |