用于疫苗接种目的的mRNA负载的聚（β-氨基酯）纳米颗粒的合成和表征
Summary
在这里，提出了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单方案，易于通过改变封装的mRNA进行定制。还描述了合成聚合物，纳米颗粒及其 体外 基本表征的工作流程。还增加了关于免疫接种的概念验证。
Abstract
疫苗接种是现代社会的重大成功之一，在控制和预防疾病方面是不可或缺的。传统疫苗由全部或部分感染因子组成。然而，挑战依然存在，新的疫苗技术是强制性的。在这种情况下，将mRNA用于免疫目的已显示出增强的性能，正如迅速批准两种预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗所证明的那样。除了成功预防病毒感染外，mRNA疫苗还可用于治疗性癌症应用。
然而，由于核酸酶的存在，mRNA的不稳定性及其从体内的快速清除使得其裸递送是不可能的。在这种情况下，纳米药物，特别是聚合物纳米颗粒，是关键的mRNA递送系统。因此，本文的目的是描述基于专有聚合物纳米颗粒的mRNA候选疫苗的配方和测试方案。本文将讨论所用聚（β-氨基酯）聚合物的合成和化学表征，它们与mRNA的络合形成纳米颗粒，以及它们的冻干方法。这是降低存储和配送成本的关键步骤。最后，将进行必要的测试，以证明其 体外 转染和成熟模型树突状细胞的能力。该协议将使从事疫苗接种工作的科学界受益，因为它具有高度的多功能性，使这些疫苗能够预防或治愈各种疾病。
Introduction
传染病对全球数百万人构成严重威胁，仍然是一些发展中国家死亡的主要原因之一。预防性疫苗接种一直是现代社会预防和控制传染病最有效的干预措施之一1，2。这些科学在20世纪相关性中的关键里程碑已经通过最近由SARS-CoV-2病毒3引起的全球Covid-19大流行来表达。认识到拥有有效疫苗以遏制疾病传播的重要性，所有生物医学界的合作努力已成功导致许多预防性疫苗在不到一年的时间内进入市场4。
传统上，疫苗由减毒（活的，降低的毒力）或灭活的（死亡颗粒）病毒组成。然而，对于一些没有安全误差余地的疾病，病毒颗粒是不可能的，而是使用蛋白质亚基。然而，亚基通常不能实现一种以上表位/抗原的组合，并且需要佐剂来增强疫苗接种效力5，6。因此，对新型疫苗类型的需求是显而易见的。
正如在当前大流行期间所表明的那样，基于核酸的新型候选疫苗在避免漫长的开发过程和提供高多功能性方面可能是有利的，同时产生重要的患者免疫接种。mRNA疫苗就是这种情况，它最初被设计为实验性癌症疫苗。由于它们产生抗原特异性T细胞反应的天然能力3，5，6，7。由于mRNA是编码抗原蛋白的分子，只是改变相同，疫苗可以快速定制以免疫同一微生物的其他变体，不同的菌株，其他传染性微生物，甚至成为癌症免疫治疗。此外，它们在大规模生产成本方面具有优势。然而，mRNA有一个阻碍其裸施用的重大障碍：其稳定性和完整性在充满核酸酶的生理介质中受到损害。因此，需要使用纳米载体来保护它并将mRNA矢量化到抗原呈递细胞2，8。
在这种情况下，聚（β-氨基酯）（pBAE）是一类生物相容性和可生物降解的聚合物，由于其阳离子电荷9，10，11，它们表现出在纳米颗粒中复合mRNA的显着能力。这些聚合物由酯键组成，这使得它们在生理条件下容易被酯酶降解。在pBAE候选文库中，那些用末端阳离子寡肽功能化的pBAE文库显示出更高的能力，可以形成小纳米颗粒，通过内吞作用有效地穿透细胞并转染包封的基因材料。此外，由于它们的缓冲能力，内体室的酸化允许内体逃逸12，13。即，一种特定类型的pBAE，包括其骨架上的疏水部分（所谓的C6 pBAE）以增强其稳定性和终寡肽组合（用三赖氨酸修饰的60%聚合物和40%的聚合物用三组氨酸修饰），其在肠胃外给药后选择性地转染抗原呈递细胞并产生mRNA编码的抗原呈递，然后进行小鼠免疫接种，最近已发表14.此外，还证明这些配方可以规避纳米医学配方的主要瓶颈步骤之一：在不失去功能的情况下冷冻干燥它们的可能性，这使得在软干燥环境中具有长期稳定性15。
在这种情况下，当前方案的目标是通过描述方案中的关键步骤并使用于传染病预防和肿瘤治疗应用的有效疫苗能够生产，使mRNA纳米颗粒的形成程序可供科学界使用。
以下方案描述了合成寡肽末端修饰聚（β-氨基酯） – OM-pBAE聚合物的完整锻炼，这些聚合物将进一步用于纳米颗粒合成。在该协议中，还包括纳米颗粒制剂。此外，还提供了程序成功的关键步骤和代表性结果，以确保所得配方完成所需的质量控制表征特征，以定义阳性或阴性结果。该协议总结在 图1中。
Protocol
Representative Results
Discussion
在去年Covid-19大流行爆发后，疫苗在传染病控制方面的重要性已表现为关键组成部分8。全世界科学家的努力使许多疫苗得以投放市场。历史上第一次，mRNA疫苗已经证明了他们以前假设的成功，这要归功于他们的快速设计，因为他们有能力在几个月内适应任何新的抗原5，6，21。mRNA或信使核糖核酸是指从DNA中的…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MINECO/FEDER（授予SAF2015-64927-C2-2-R，RTI2018-094734-B-C22和COV20/01100）的财政支持得到确认。CGF承认了她的IQS博士奖学金。
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
Riferimenti
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D’Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
