Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.
Vaccinatie is een van de grootste successen van de moderne samenleving en is onmisbaar bij het beheersen en voorkomen van ziekten. Traditionele vaccins waren samengesteld uit hele of fracties van het infectieuze agens. Er blijven echter uitdagingen en nieuwe vaccintechnologieën zijn verplicht. In deze context heeft het gebruik van mRNA voor immuniserende doeleinden een verbeterde prestatie laten zien, zoals blijkt uit de snelle goedkeuring van twee mRNA-vaccins die SARS-CoV-2-infectie voorkomen. Naast succes bij het voorkomen van virale infecties, kunnen mRNA-vaccins ook worden gebruikt voor therapeutische kankertoepassingen.
Niettemin maakt de instabiliteit van mRNA en de snelle klaring uit het lichaam als gevolg van de aanwezigheid van nucleasen de naakte afgifte ervan niet mogelijk. In deze context zijn nanogeneesmiddelen, en specifiek polymere nanodeeltjes, kritieke mRNA-afgiftesystemen. Het doel van dit artikel is dus om het protocol te beschrijven voor de formulering en test van een kandidaat-mRNA-vaccin op basis van de gepatenteerde polymere nanodeeltjes. De synthese en chemische karakterisering van de gebruikte poly(bèta-aminoesters)polymeren, hun complexatie met mRNA om nanodeeltjes te vormen en hun lyofilisatiemethodologie zullen hier worden besproken. Dit is een cruciale stap voor het verlagen van opslag- en distributiekosten. Ten slotte zullen de vereiste tests worden aangegeven om hun vermogen aan te tonen om in vitro transfecterende en volwassen modelleer dendritische cellen te modelleren. Dit protocol zal de wetenschappelijke gemeenschap die aan vaccinatie werkt ten goede komen vanwege de hoge veelzijdigheid die deze vaccins in staat stelt een breed scala aan ziekten te voorkomen of te genezen.
Infectieziekten vormen een ernstige bedreiging voor miljoenen mensen over de hele wereld en zijn nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken in sommige ontwikkelingslanden. Profylactische vaccinatie is een van de meest effectieve interventies van de moderne samenleving om infectieziekten te voorkomen en te beheersen1,2. Deze kritieke mijlpalen van de wetenschap in de relevantie van de20eeeuw zijn opgemerkt door de recente wereldwijde Covid-19-pandemie veroorzaakt door het SARS-CoV-2-virus3. Erkennend het belang van het hebben van efficiënte vaccins om de verspreiding van de ziekte te beperken, hebben coöperatieve inspanningen van alle biomedische gemeenschappen met succes geresulteerd in veel profylactische vaccins op de markt in minder dan een jaar4.
Traditioneel werden vaccins samengesteld uit verzwakte (levende, verminderde virulentie) of geïnactiveerde (doodsdeeltjes) virussen. Voor sommige ziekten zonder marge voor veiligheidsfouten zijn virale deeltjes echter niet mogelijk en worden in plaats daarvan eiwitsubeenheden gebruikt. Niettemin maken subeenheden meestal de combinatie van meer dan één epitoop / antigeen niet mogelijk en zijn adjuvantia nodig om de vaccinatiepotentie te verbeteren5,6. Daarom is de behoefte aan nieuwe vaccintypen duidelijk.
Zoals aangetoond tijdens de huidige pandemie, kunnen nieuwe vaccinkandidaten op basis van nucleïnezuren voordelig zijn in termen van het vermijden van lange ontwikkelingsprocessen en het bieden van een hoge veelzijdigheid terwijl tegelijkertijd een vitale patiëntimmunisatie wordt geproduceerd. Dit is het geval met mRNA-vaccins, die aanvankelijk werden ontworpen als experimentele kankervaccins. Dankzij hun natuurlijke vermogen om antigeenspecifieke T-celresponsen3,5,6,7te produceren. Omdat mRNA het molecuul is dat codeert voor het antigene eiwit en alleen hetzelfde verandert, kan het vaccin snel worden aangepast om andere varianten van hetzelfde micro-organisme, verschillende stammen, andere infectieuze micro-organismen te immuniseren of zelfs een immunotherapeutische behandeling voor kanker te worden. Bovendien zijn ze voordelig in termen van grootschalige productiekosten. MRNA heeft echter een belangrijke hindernis die hun naakte toediening belemmert: de stabiliteit en integriteit ervan worden aangetast in fysiologische media, vol met nucleasen. Om deze reden is het gebruik van een nanometrische drager die het beschermt en mRNA vectoriseert naar de antigeen-presenterende cellen vereist2,8.
In deze context zijn poly (bèta-aminoesters) (pBAE) een klasse van biocompatibele en biologisch afbreekbare polymeren die een opmerkelijk vermogen hebben aangetoond om mRNA in nanometrische deeltjes te complexeren, dankzij hun kationische ladingen9,10,11. Deze polymeren zijn samengesteld uit esterbindingen, waardoor hun afbraak door esterasen in fysiologische omstandigheden gemakkelijk wordt. Onder de pBAE-bibliotheekkandidaten vertoonden degenen die gefunctionaliseerd waren met end kationische oligopeptiden een hoger vermogen om kleine nanodeeltjes te vormen om cellen efficiënt binnen te dringen via endocytose en het ingekapselde genmateriaal te transfecteren. Bovendien maakt de verzuring van het endosoomcompartiment dankzij hun buffercapaciteit endosomale ontsnapping12,13mogelijk. Namelijk, een specifiek soort pBAE, inclusief hydrofobe moieties op hun ruggengraat (de zogenaamde C6 pBAE) om hun stabiliteit en eind-oligopeptide combinatie te verbeteren (60% van het polymeer gemodificeerd met een tri-lysine en 40% van het polymeer met een tri-histidine) die selectief antigeen-presenterende cellen transfecteert na parenterale toediening en de mRNA-gecodeerde antigeenpresentatie produceert gevolgd door muizenimmunisatie is onlangs gepubliceerd14 . Bovendien is ook aangetoond dat deze formuleringen een van de belangrijkste knelpuntstappen van nanogeneeskundeformuleringen kunnen omzeilen: de mogelijkheid om ze te vriesdrogen zonder hun functionaliteit te verliezen, wat langdurige stabiliteit in zachte droge omgevingen mogelijk maakt15.
In deze context is het doel van het huidige protocol om de procedure voor de vorming van de mRNA-nanodeeltjes beschikbaar te maken voor de wetenschappelijke gemeenschap door een beschrijving te geven van de kritieke stappen in het protocol en de productie van efficiënte vaccins voor infectieziektenpreventie en tumorbehandelingstoepassingen mogelijk te maken.
Het volgende protocol beschrijft de volledige training om oligopeptide end-modified poly (beta aminoesters) – OM-pBAE polymeren te synthetiseren die verder zullen worden gebruikt voor nanodeeltjessynthese. In het protocol is ook de formulering van nanodeeltjes opgenomen. Bovendien worden ook kritieke stappen voor het succes van de procedure en representatieve resultaten gegeven om ervoor te zorgen dat de resulterende formuleringen voldoen aan de vereiste karakteriseringskenmerken voor kwaliteitscontrole om een positief of negatief resultaat te definiëren. Dit protocol is samengevat in figuur 1.
Na de uitbraak van de Covid-19-pandemie vorig jaar heeft het belang van vaccins in termen van infectieziektebestrijding zich gemanifesteerd als een cruciaal onderdeel8. Inspanningen van wetenschappers over de hele wereld hebben de introductie op de markt van veel vaccins mogelijk gemaakt. Voor het eerst in de geschiedenis hebben mRNA-vaccins hun eerder veronderstelde succes aangetoond, dankzij hun snelle ontwerp vanwege hun vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan elk nieuw antigee…
The authors have nothing to disclose.
Financiële steun van MINECO/FEDER (subsidies SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 en COV20/01100) wordt erkend. CGF erkende haar IQS PhD Fellowship.
1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
Acetone | Panreac | 141007 | |
CD11b antibody | BD | 550993 | |
CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
Equipment | |||
Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
Software | |||
NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |