टीकाकरण प्रयोजनों के लिए एमआरएनए-लोडेड पॉली (बीटा अमीनोस्टर्स) नैनोकणों का संश्लेषण और लक्षण वर्णन
Summary
यहां, पॉली (बीटा अमीनोस्टर) पॉलिमर के आधार पर एमआरएनए नैनोकणों के उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जो एनकैप्सुलेटेड mRNA को बदलकर तैयार किया जाना आसान है। पॉलिमर, नैनोकणों और उनके इन विट्रो आवश्यक लक्षण वर्णन को संश्लेषित करने के लिए कार्यप्रवाह का भी वर्णन किया गया है। प्रतिरक्षण के संबंध में एक प्रमाण-अवधारणा भी जोड़ी गई है।
Abstract
टीकाकरण आधुनिक समाज की प्रमुख सफलताओं में से एक रहा है और रोग को नियंत्रित करने और रोकने में अपरिहार्य है । पारंपरिक टीके संक्रामक एजेंट के पूरे या अंशों से बने थे। हालांकि, चुनौतियां बनी हुई हैं, और नई वैक्सीन प्रौद्योगिकियां अनिवार्य हैं । इस संदर्भ में, प्रतिरक्षण प्रयोजनों के लिए एमआरएनए के उपयोग ने एक बढ़ाया प्रदर्शन दिखाया है, जैसा कि सार्स-सीओवी-2 संक्रमण को रोकने वाले दो एमआरएनए टीकों के त्वरित अनुमोदन से प्रदर्शित किया गया है । वायरल संक्रमण को रोकने में सफलता से परे, mRNA टीके भी चिकित्सकीय कैंसर अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
फिर भी, एमआरएनए की अस्थिरता और नाभिक की उपस्थिति के कारण शरीर से इसकी तेजी से निकासी इसकी नग्न डिलीवरी संभव नहीं बनाती है। इस संदर्भ में, नैनोमेडिसिन, और विशेष रूप से पॉलीमेरिक नैनोकण, महत्वपूर्ण एमआरएनए डिलीवरी सिस्टम हैं। इस प्रकार, इस लेख का उद्देश्य मालिकाना बहुलक नैनोकणों के आधार पर एक एमआरएनए वैक्सीन उम्मीदवार के निर्माण और परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। पॉली (बीटा अमीनोएस्टर्स) पॉलिमर के संश्लेषण और रासायनिक लक्षण वर्णन, नैनोकण बनाने के लिए एमआरएनए के साथ उनकी जटिलता और उनकी लाइफिलाइजेशन पद्धति पर यहां चर्चा की जाएगी। यह भंडारण और वितरण लागत को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । अंत में, इन विट्रो ट्रांसफेक्ट और परिपक्व मॉडल डेंड्रिटिक कोशिकाओं के लिए अपनी क्षमता प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक परीक्षणों का संकेत दिया जाएगा । इस प्रोटोकॉल से टीकाकरण पर काम कर रहे वैज्ञानिक समुदाय को इसकी उच्च बहुमुखी प्रतिभा का लाभ मिलेगा जो इन टीकों को विभिन्न प्रकार की बीमारियों को रोकने या ठीक करने में सक्षम बनाता है ।
Introduction
संक्रामक रोगों दुनिया भर के मनुष्यों के लाखों लोगों के लिए एक गंभीर खतरे का प्रतिनिधित्व किया है और अभी भी कुछ विकासशील देशों में मौत के प्रमुख कारणों में से एक हैं । रोगनिरोधी टीकाकरण संक्रामक रोगों को रोकने और नियंत्रित करने के लिए आधुनिक समाज के सबसे प्रभावी हस्तक्षेपों में से एक रहा है1,2. 20वींशताब्दी की प्रासंगिकता में विज्ञान के ये महत्वपूर्ण मील के पत्थर हाल ही में दुनिया भर में कोविड-19 महामारी सार्स-सीओवी-2 वायरस 3 के कारणहुएहैं। रोग के प्रसार में कटौती करने के लिए कुशल टीके होने के महत्व को समझते हुए, सभी जैव चिकित्सा समुदायों के सहकारी प्रयासों के परिणामस्वरूप एक वर्ष से भी कम समय में बाजार में कई रोगनिरोधी टीकेोंका परिणाम हुआ है ।
परंपरागत रूप से, टीके तनु (रहते हैं, कम उग्रता) या निष्क्रिय (मौत के कणों) वायरस से बना थे । हालांकि, सुरक्षा त्रुटियों के लिए कोई मार्जिन के साथ कुछ रोगों के लिए, वायरल कणों संभव नहीं हैं, और प्रोटीन उपइकाइक्स के बजाय उपयोग किया जाता है । फिर भी, उपइकाइट्स आमतौर पर एक से अधिक एपिटोप/एंटीजन के संयोजन को सक्षम नहीं करते हैं, और टीकाकरण शक्ति5,6को बढ़ाने के लिए एडजुवेंट्स की आवश्यकता होती है। इसलिए, उपन्यास वैक्सीन प्रकारों की आवश्यकता स्पष्ट है।
जैसा कि वर्तमान महामारी के दौरान प्रदर्शित किया गया है, न्यूक्लिक एसिड पर आधारित उपन्यास वैक्सीन उम्मीदवार लंबी विकास प्रक्रियाओं से बचने और उत्पादन करते समय उच्च बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने के मामले में लाभप्रद हो सकते हैं, एक ही समय में, एक महत्वपूर्ण रोगी प्रतिरक्षण। यह एमआरएनए टीकों का मामला है, जिन्हें शुरू में प्रायोगिक कैंसर के टीके के रूप में डिजाइन किया गया था । एंटीजन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने की उनकी प्राकृतिक क्षमता के लिए धन्यवाद3,5,6,7। एमआरएनए होने के कारण अणु जो एंटीजेनिक प्रोटीन को एन्कोड करता है, केवल उसी को बदलता है, टीका को एक ही सूक्ष्मजीव के अन्य रूपों, विभिन्न उपभेदों, अन्य संक्रामक सूक्ष्मजीवों को प्रतिरक्षित करने के लिए तेजी से सिलवाया जा सकता है, या यहां तक कि कैंसर इम्यूनोथेरपी उपचार भी बन सकता है। इसके अलावा, वे बड़े पैमाने पर उत्पादन लागत के मामले में लाभप्रद हैं । हालांकि, एमआरएनए में एक महत्वपूर्ण बाधा है जो उनके नग्न प्रशासन को बाधित करती है: इसकी स्थिरता और अखंडता शारीरिक मीडिया में समझौता किया जाता है, जो नाभिक से भरा होता है। इस कारण से, एक नैनोमेट्रिक वाहक का उपयोग जो इसकी रक्षा करता है और एंटीजन-पेश करने वाली कोशिकाओं को एमआरएनए को वेक्टराइज करताहै,2,8आवश्यक है।
इस संदर्भ में, पॉली (बीटा अमीनोएस्टर) (पीबीई) जैव संगत और बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर का एक वर्ग है जिसने नैनोमेट्रिक कणों में जटिल एमआरएनए की उल्लेखनीय क्षमता का प्रदर्शन किया, उनके cationic शुल्क9,10,11के लिए धन्यवाद। ये पॉलिमर एस्टर बांड से बने होते हैं, जो शारीरिक परिस्थितियों में एस्टरस द्वारा उनके क्षरण को आसान बनाता है। पीबीएई पुस्तकालय उम्मीदवारों में, अंत cationic ओलिइगोपेप्टाइड्स के साथ कार्यात्मक लोगों ने एंडोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक प्रवेश करने और एनकैप्सुलेटेड जीन सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए छोटे नैनोकणों को बनाने की उच्च क्षमता दिखाई। इसके अलावा, उनकी बफरिंग क्षमता के लिए धन्यवाद, एंडोसोम डिब्बे का अम्लीकरण एंडोसोमलएस्केप 12,13की अनुमति देता है। अर्थात्, एक विशिष्ट प्रकार का पीबीएई, उनकी रीढ़ की हड्डी पर हाइड्रोफोबिक मोइटीज सहित (तथाकथित C6 pBAE) उनकी स्थिरता और अंत-ओलिगोपेप्टाइड संयोजन (60% बहुलक को त्रि-lysine और 40% के साथ संशोधित करने के लिए एक त्रिकोणीय हिस्टिडीन के साथ बहुलक) जो चुनिंदा रूप से पेरेंटल प्रशासन के बाद एंटीजन-पेश कोशिकाओं को स्थानांतरित करता है और चूहों प्रतिरक्षण के बाद एमआरएनए इनकोडेड एंटीजन प्रस्तुति का उत्पादन करता है, हाल ही में14 प्रकाशित किया गया है . इसके अलावा, यह भी प्रदर्शित किया गया है कि ये योग नैनोमेडिसिन फॉर्मूलेशन के मुख्य अड़चन चरणों में से एक को दरकिनार कर सकते हैं: उनकी कार्यक्षमता को खोने के बिना उन्हें फ्रीज-ड्राई करने की संभावना है, जो नरम शुष्क वातावरण15 में दीर्घकालिक स्थिरताको सक्षम बनाता है।
इस संदर्भ में, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों का विवरण देकर और संक्रामक रोगों की रोकथाम और ट्यूमर उपचार अनुप्रयोगों के लिए कुशल टीकों के उत्पादन को सक्षम करके वैज्ञानिक समुदाय को एमआरएनए नैनोकणों के गठन की प्रक्रिया बनाना है ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल ओलिगोपेप्टाइड एंड-संशोधित पॉली (बीटा अमीनोएस्टर) को संश्लेषित करने के लिए पूरी कसरत का वर्णन करता है – ओम-पीबीए पॉलीमर जिसका उपयोग नैनोपार्टिकल संश्लेषण के लिए आगे किया जाएगा। प्रोटोकॉल में नैनोपार्टिकल्स फॉर्मूलेशन को भी शामिल किया गया है। इसके अलावा, प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम और प्रतिनिधि परिणाम भी यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदान किए जाते हैं कि परिणामस्वरूप योगों एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम को परिभाषित करने के लिए आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण लक्षण वर्णन सुविधाओं को पूरा करते हैं । इस प्रोटोकॉल को चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले साल कोविड-19 महामारी के फैलने के बाद, संक्रामक रोग नियंत्रण के मामले में टीकों का महत्व एक महत्वपूर्ण घटक8के रूप में प्रकट हुआ है । दुनिया भर के वैज्ञानिकों के प्रयासों ने कई टीकों के बाजा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MINECO/FEDER से वित्तीय सहायता (अनुदान SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22, और COV20/01100) स्वीकार किया है । सीजीएफ ने उसे आईक्यूएस पीएचडी फेलोशिप स्वीकार किया ।
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
Riferimenti
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