mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화
Summary
여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.
Abstract
예방 접종은 현대 사회의 주요 성공 중 하나이며 질병을 통제하고 예방하는 데 필수적입니다. 전통적인 백신은 전염하는 에이전트의 전체 또는 분수로 구성되었다. 그러나 과제는 남아 있으며 새로운 백신 기술은 필수입니다. 이러한 맥락에서, 예방 접종 목적을 위한 mRNA의 사용은 SARS-CoV-2 감염을 방지하는 2개의 mRNA 백신의 신속한 승인에 의해 입증된 바와 같이 향상된 성능을 보여주었습니다. 바이러스 감염 예방에 성공 하는 것 외에도 mRNA 백신 치료 암 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
그럼에도 불구 하 고, mRNA의 불안정과 핵의 존재로 인해 신체에서 그것의 빠른 간격은 그것의 알몸 배달 불가능. 이러한 맥락에서, 나노 의약품 및 특히 중합체 나노 입자는 중요한 mRNA 전달 시스템입니다. 따라서, 본 문서의 목적은 독점적 중합체 나노입자에 기초하여 mRNA 백신 후보의 제형 및 시험을 위한 프로토콜을 기술하는 것이다. 폴리(베타 아미노에스) 폴리머의 합성 및 화학적 특성화, 나노입자를 형성하기 위한 mRNA와의 복합성, 및 이들의 구종화 방법론이 여기에서 논의될 것이다. 이는 스토리지 및 유통 비용을 줄이는 중요한 단계입니다. 마지막으로, 시험관 내 및 성숙한 모델 수지상 세포에 대한 능력을 입증하는 데 필요한 검사가 표시됩니다. 이 프로토콜은 이러한 백신이 다양한 질병을 예방하거나 치료할 수 있도록 하는 높은 다기능성 때문에 예방 접종에 종사하는 과학 계에 도움이 될 것입니다.
Introduction
전염병은 전 세계 수백만 명의 인간에게 심각한 위협을 나타내고 있으며 여전히 일부 개발 도상국에서 주요 사망 원인 중 하나입니다. 예방 접종은 전염병을 예방하고 통제하기 위해 현대 사회의 가장 효과적인 개입 중 하나였습니다1,2. 20세기관련성에 있는 과학의 이 중요한 이정표는 SARS-CoV-2 바이러스3에기인한 최근 세계적인 Covid-19 전염병에 의해 언급되었습니다. 질병의 보급을 줄이기 위해 효율적인 백신을 갖는 것의 중요성을 인식, 모든 생물 의학 지역 사회에서 협력 노력은 성공적으로 1 년 이내에 시장에서 많은 예방 백신을 초래했다4.
전통적으로, 백신은 감쇠 (살아있는, 감소된 독성) 또는 불활성화 (죽음 입자) 바이러스로 구성되었다. 그러나, 안전 오류에 대한 여백이없는 일부 질병의 경우, 바이러스 성 입자는 불가능하고, 단백질 하위 단위는 대신 사용된다. 그럼에도 불구하고, 서브유닛은 일반적으로 하나 이상의 에피토프/항원의 조합을 활성화하지 않으며, 유족은 백신 접종 효능5,6을향상시켜야 한다. 따라서 새로운 백신 유형에 대한 필요성은 분명합니다.
현재 전염병 동안 입증된 바와 같이, 핵산을 기반으로 한 새로운 백신 후보는 긴 발달 과정을 피하고 동시에 중요한 환자 예방 접종을 생산하는 동안 높은 다기능성을 제공하는 측면에서 유리할 수 있다. 이것은 처음에 실험적인 암 백신으로 디자인된 mRNA 백신의 케이스입니다. 항원 특이적 T세포 반응3,5,6,7을생성하는 자연적인 능력 덕분. mRNA는 항원 단백질을 인코딩하는 분자로서, 단지 동일하게 변화하는, 백신은 동일한 미생물, 다른 균주, 다른 전염성 미생물의 다른 변이체를 예방 접종하기 위해 신속하게 조정될 수 있거나, 심지어 암 면역 치료 치료법이 될 수 있다. 또한 대규모 생산 비용 면에서 유리합니다. 그러나, mRNA는 그들의 벌거 벗은 행정을 방해하는 중요한 장애물이 있습니다: 그것의 안정성 및 무결성은 생리적인 매체에서 손상됩니다, 핵의 가득 차있는. 이러한 이유로, 이를 보호하고 mRNA를 항원 제시 세포로 벡터화하는 나노메트릭 담체의 사용은2,8이필요하다.
이러한 맥락에서, 폴리(베타 아미노에스)(pBAE)는 생체적합성 및 생분해성 폴리머의 일종으로, 양이온화9,10,11덕분에나노메트릭 입자에서 mRNA를 복합화하는 놀라운 능력을 입증하였다. 이 중합체는 생리적인 조건에서 에스테라아에 의해 그들의 분해를 쉽게 만드는 에스테르 결합으로 이루어집니다. pBAE 라이브러리 후보 중, 종말 양이온 올리고펩타이드로 기능화된 사람들은 내분비증을 통해 세포를 효율적으로 침투시키고 캡슐화된 유전자 물질을 이식하기 위해 작은 나노입자를 형성하는 더 높은 용량을 보였다. 또한, 버퍼링 용량 덕분에 내성 구획의 산성화는 내도 탈출12,13을허용한다. 즉, pBAE의 특정 종류, 그들의 백본에 소수성 모니티를 포함 (소위 C6 pBAE) 그들의 안정성을 향상 시키고 말 올리고펩티드 조합 (3-lysine로 변형 된 폴리머의 60%와 삼부스티딘을 가진 폴리머의 40%)는 비경구 투여 후 항원 제시 세포를 선택적으로 트랜스펙트 및 mRNA 코드 내포 항원 발표1 . 또한, 이러한 제형은 나노의학 제제의 주요 병목 현상 단계 중 하나를 우회할 수 있다는 것을 입증하였다: 그들의 기능을 잃지 않고 동결 건조할 수 있는 가능성, 이는 연약한 건조한 환경에서 장기적인 안정성을 가능하게한다(15).
이러한 맥락에서, 현재 프로토콜의 목적은 프로토콜의 중요한 단계에 대한 설명을 제공하고 전염병 예방 및 종양 치료 응용을 위한 효율적인 백신의 생산을 가능하게 함으로써 과학 계에 사용할 수 있는 mRNA 나노입자의 형성을 위한 절차를 만드는 것이다.
다음 프로토콜은 올리고펩티드 최종 변형 폴리(베타 아미노에스)를 합성하기 위한 완전한 운동을 설명합니다- 나노입자 합성에 더 사용될 OM-pBAE 폴리머. 프로토콜에서, 나노입자 제형도 포함되어 있다. 또한, 절차 및 대표 결과의 성공을 위한 중요한 단계는 또한 결과 제형이 양수 또는 음수 결과를 정의하는 데 필요한 품질 관리 특성화 기능을 달성할 수 있도록 제공된다. 이 프로토콜은 그림 1로요약되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
작년에 Covid-19 전염병이 발병한 후, 전염병 통제 측면에서 백신의 중요성은 중요한 구성 요소8로나타났다. 전 세계 과학자들의 노력으로 많은 백신 시장이 출시되었습니다. 역사상 처음으로 mRNA 백신은 몇달내에 새로운 항원5,6,21에적응할 수 있는 능력 때문에 빠른 설계 덕분에 이전에 가설적인 성공을 입증했…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마인코/FEDER의 재정 지원(SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22, COV20/01100)의 재정 지원이 인정됩니다. CGF는 그녀의 IQS 박사 학위 펠로우십을 인정했다.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
Riferimenti
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