Синтез и характеристика наночастиц поли(бета-аминоэфиров), нагруженных мРНК, для целей вакцинации
Summary
Здесь представлен простой протокол получения наночастиц мРНК на основе поли(бета-аминоэфирных) полимеров, который легко адаптировать путем изменения инкапсулированной мРНК. Также описан рабочий процесс синтеза полимеров, наночастиц и их сущностной характеристики in vitro. Также добавляется доказательство концепции иммунизации.
Abstract
Вакцинация является одним из главных успехов современного общества и необходима для борьбы с болезнями и их профилактики. Традиционные вакцины состояли из целых или фракций инфекционного агента. Тем не менее, проблемы остаются, и новые вакцинные технологии являются обязательными. В этом контексте использование мРНК для целей иммунизации показало повышенную эффективность, о чем свидетельствует быстрое одобрение двух мРНК-вакцин, предотвращающих инфекцию SARS-CoV-2. Помимо успеха в предотвращении вирусных инфекций, мРНК-вакцины также могут использоваться для терапевтического применения рака.
Тем не менее, нестабильность мРНК и ее быстрое выведение из организма из-за наличия нуклеаз делает ее голую доставку невозможной. В этом контексте нанолекарства и, в частности, полимерные наночастицы являются критическими системами доставки мРНК. Таким образом, целью данной статьи является описание протокола составления и испытания мРНК-вакцины-кандидата на основе запатентованных полимерных наночастиц. Синтез и химическая характеристика используемых поли(бета-аминоэфиров) полимеров, их комплексообразование с мРНК с образованием наночастиц и методология их лиофилизации будут обсуждаться здесь. Это важный шаг для снижения затрат на хранение и дистрибуцию. Наконец, будут указаны необходимые тесты для демонстрации их способности к трансфекции in vitro и зрелой модели дендритных клеток. Этот протокол принесет пользу научному сообществу, работающему над вакцинацией, из-за его высокой универсальности, которая позволяет этим вакцинам предотвращать или лечить широкий спектр заболеваний.
Introduction
Инфекционные заболевания представляют собой серьезную угрозу для миллионов людей во всем мире и по-прежнему являются одной из ведущих причин смерти в некоторых развивающихся странах. Профилактическая вакцинация является одним из наиболее эффективных вмешательств современного общества по профилактике и борьбе с инфекционными заболеваниями1,2. Эти критические вехи науки в актуальности20-говека были отмечены недавней всемирной пандемией Covid-19, вызванной вирусом SARS-CoV-23. Признавая важность наличия эффективных вакцин для сдерживания распространения болезни, совместные усилия всех биомедицинских сообществ успешно привели к появлению на рынке многих профилактических вакцин менее чем за4года.
Традиционно вакцины состояли из ослабленных (живых, пониженной вирулентности) или инактивированных (частиц смерти) вирусов. Однако для некоторых заболеваний, не имеющих запаса для ошибок безопасности, вирусные частицы невозможны, и вместо них используются белковые субъединицы. Тем не менее, субъединицы обычно не позволяют комбинировать более одного эпитопа/антигена, а адъюванты необходимы для повышения эффективности вакцинации5,6. Поэтому потребность в новых типах вакцин очевидна.
Как было продемонстрировано во время нынешней пандемии, новые вакцины-кандидаты на основе нуклеиновых кислот могут быть выгодными с точки зрения избежания длительных процессов разработки и обеспечения высокой универсальности при одновременном проведении жизненно важной иммунизации пациента. Это относится к мРНК-вакцинам, которые изначально были разработаны как экспериментальные противораковые вакцины. Благодаря их естественной способности вырабатывать антиген-специфические Т-клеточные ответы3,5,6,7. Будучи мРНК молекулой, которая кодирует антигенный белок, только изменяя один и тот же, вакцина может быть быстро адаптирована для иммунизации других вариантов того же микроорганизма, различных штаммов, других инфекционных микроорганизмов или даже стать иммунотерапевтическим средством лечения рака. Кроме того, они выгодны с точки зрения масштабных производственных затрат. Однако мРНК имеет значительное препятствие, которое препятствует их голому введению: ее стабильность и целостность скомпрометированы в физиологических средах, полных нуклеаз. По этой причине требуется использование нанометрического носителя, который защищает его и векторизует мРНК к антигенпрезентирующим клеткам2,8.
В этом контексте поли(бета-аминоэфиры) (pBAE) представляют собой класс биосовместимых и биоразлагаемых полимеров, которые продемонстрировали замечательную способность к комплексу мРНК в нанометрических частицах, благодаря их катионным зарядам9,10,11. Эти полимеры состоят из эфирных связей, что облегчает их деградацию эстеразами в физиологических условиях. Среди кандидатов в библиотеку pBAE те, кто функционализирован конечными катионными олигопептидами, показали более высокую способность образовывать небольшие наночастицы для эффективного проникновения в клетки через эндоцитоз и трансфекции инкапсулированного генного материала. Кроме того, благодаря их буферной способности, подкисление эндосомного отсека позволяет эндосомному выходу12,13. А именно, недавно был опубликован специфический вид pBAE, включая гидрофобные фрагменты на их позвоночнике (так называемый C6 pBAE) для повышения их стабильности и концево-олигопептидную комбинацию (60% полимера, модифицированного три-лизином и 40% полимера с три-гистидином), которая избирательно трансфектирует антигенпрезентирующие клетки после парентерального введения и производит презентацию антигена, кодированную мРНК, с последующей иммунизацией мышей14 . Кроме того, также было продемонстрировано, что эти составы могут обойти одно из основных узких мест наномедицинских составов: возможность сублимационной сушки их без потери их функциональности, что обеспечивает долгосрочную стабильность в мягких сухих средах15.
В этом контексте целью текущего протокола является предоставление процедуры формирования наночастиц мРНК научному сообществу путем описания критических шагов в протоколе и создания возможностей для производства эффективных вакцин для профилактики инфекционных заболеваний и лечения опухолей.
Следующий протокол описывает полную тренировку по синтезу олигопептидных концевых модифицированных поли(бета-аминоэфиров) – полимеров OM-pBAE, которые в дальнейшем будут использоваться для синтеза наночастиц. В протокол также включена формулировка наночастиц. Кроме того, предусмотрены критические шаги для успеха процедуры и репрезентативные результаты для обеспечения того, чтобы полученные составы выполняли требуемые характеристики контроля качества для определения положительного или отрицательного результата. Этот протокол обобщен на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
После вспышки пандемии Covid-19 в прошлом году важность вакцин с точки зрения борьбы с инфекционными заболеваниями проявилась как критический компонент8. Усилия ученых со всего мира позволили выпустить на рынок многие вакцины. Впервые в истории мРНК-вакцины продемонстрирова?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка со стороны МИНЕКО/ФЕДЕР (гранты SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 и COV20/01100). CGF признал ее стипендию IQS PhD.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
Riferimenti
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D’Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
