Síntesis y caracterización de nanopartículas de poli(beta aminoésteres) cargadas de ARNm con fines de vacunación
Summary
Aquí, se presenta un protocolo simple para producir nanopartículas de ARNm basadas en polímeros de poli(beta aminoéster), fáciles de adaptar cambiando el ARNm encapsulado. También se describe el flujo de trabajo para sintetizar los polímeros, las nanopartículas y su caracterización esencial in vitro. También se agrega una prueba de concepto con respecto a la inmunización.
Abstract
La vacunación ha sido uno de los mayores éxitos de la sociedad moderna y es indispensable para controlar y prevenir enfermedades. Las vacunas tradicionales estaban compuestas por enteros o fracciones del agente infeccioso. Sin embargo, siguen existiendo desafíos y las nuevas tecnologías de vacunación son obligatorias. En este contexto, el uso de ARNm con fines de inmunización ha demostrado un mejor rendimiento, como lo demuestra la rápida aprobación de dos vacunas de ARNm que previenen la infección por SARS-CoV-2. Más allá del éxito en la prevención de infecciones virales, las vacunas de ARNm también se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas contra el cáncer.
Sin embargo, la inestabilidad del ARNm y su rápida eliminación del cuerpo debido a la presencia de nucleasas hace que su entrega desnuda no sea posible. En este contexto, las nanomedicamentos, y específicamente las nanopartículas poliméricas, son sistemas críticos de administración de ARNm. Por lo tanto, el objetivo de este artículo es describir el protocolo para la formulación y prueba de un candidato a vacuna de ARNm basado en las nanopartículas poliméricas patentadas. La síntesis y caracterización química de los polímeros poli(beta aminoésteres) utilizados, su complejación con ARNm para formar nanopartículas y su metodología de liofilización se discutirán aquí. Este es un paso crucial para disminuir los costos de almacenamiento y distribución. Por último, se indicarán las pruebas necesarias para demostrar su capacidad de transfectar in vitro y madurar células dendríticas modelo. Este protocolo beneficiará a la comunidad científica que trabaja en la vacunación debido a su alta versatilidad que permite a estas vacunas prevenir o curar una amplia variedad de enfermedades.
Introduction
Las enfermedades infecciosas han representado una grave amenaza para millones de seres humanos en todo el mundo y siguen siendo una de las principales causas de muerte en algunos países en desarrollo. La vacunación profiláctica ha sido una de las intervenciones más eficaces de la sociedad moderna para prevenir y controlar las enfermedadesinfecciosas1,2. Estos hitos críticos de la ciencia en relevancia del sigloXXhan sido señalados por la reciente pandemia mundial de Covid-19 causada por el virus SARS-CoV-23. Reconociendo la importancia de contar con vacunas eficientes para reducir la diseminación de la enfermedad, los esfuerzos cooperativos de todas las comunidades biomédicas han dado como resultado con éxito muchas vacunas profilácticas en el mercado en menos de un año4.
Tradicionalmente, las vacunas se componían de virus atenuados (vivos, de virulencia reducida) o inactivados (partículas de muerte). Sin embargo, para algunas enfermedades sin margen de errores de seguridad, las partículas virales no son posibles, y en su lugar se utilizan subunidades de proteínas. Sin embargo, las subunidades generalmente no permiten la combinación de más de un epítopo / antígeno, y se requieren adyuvantes para mejorar la potencia de vacunación5,6. Por lo tanto, la necesidad de nuevos tipos de vacunas es clara.
Como se demostró durante la pandemia actual, las nuevas vacunas candidatas basadas en ácidos nucleicos pueden ser ventajosas en términos de evitar largos procesos de desarrollo y proporcionar una alta versatilidad al tiempo que producen, al mismo tiempo, una inmunización vital para el paciente. Este es el caso de las vacunas de ARNm, que inicialmente fueron diseñadas como vacunas experimentales contra el cáncer. Gracias a su capacidad natural para producir respuestas de células T específicas de antígenos3,5,6,7. Al ser el ARNm la molécula que codifica la proteína antigénica, solo cambiando la misma, la vacuna puede adaptarse rápidamente para inmunizar otras variantes del mismo microorganismo, diferentes cepas, otros microorganismos infecciosos, o incluso convertirse en un tratamiento inmunoterapéutico contra el cáncer. Además, son ventajosos en términos de costos de producción a gran escala. Sin embargo, el ARNm tiene un obstáculo importante que dificulta su administración desnuda: su estabilidad e integridad se ven comprometidas en medios fisiológicos, llenos de nucleasas. Por esta razón, se requiere el uso de un portador nanométrico que lo proteja y vectorice el ARNm a las células presentadoras de antígenos2,8.
En este contexto, los poli(beta aminoésteres) (pBAE) son una clase de polímeros biocompatibles y biodegradables que demostraron una notable capacidad para complejar el ARNm en partículas nanométricas, gracias a sus cargas catiónicas9,10,11. Estos polímeros están compuestos por enlaces éster, lo que facilita su degradación por las esterasas en condiciones fisiológicas. Entre los candidatos a la biblioteca pBAE, los funcionalizados con oligopéptidos catiónicos finales mostraron una mayor capacidad para formar nanopartículas pequeñas para penetrar eficientemente en las células a través de la endocitosis y transfectar el material genético encapsulado. Además, gracias a su capacidad de amortiguación, la acidificación del compartimento endosómico permite el escape endosomal12,13. A saber, un tipo específico de pBAE, incluyendo partes hidrofóbicas en su columna vertebral (el llamado C6 pBAE) para mejorar su estabilidad y combinación de oligopéptidos finales (60% de polímero modificado con una tri-lisina y 40% del polímero con una tri-histidina) que transfecta selectivamente las células presentadoras de antígenos después de la administración parenteral y produce la presentación del antígeno codificado en ARNm seguido de la inmunización de ratones se ha publicado recientemente14 . Además, también se ha demostrado que estas formulaciones podrían sortear uno de los principales pasos de cuello de botella de las formulaciones de nanomedicina: la posibilidad de liofilizarlas sin perder su funcionalidad, lo que permite la estabilidad a largo plazo en ambientes secos suaves15.
En este contexto, el objetivo del protocolo actual es poner a disposición de la comunidad científica el procedimiento para la formación de las nanopartículas de ARNm, dando una descripción de los pasos críticos en el protocolo y permitiendo la producción de vacunas eficientes para la prevención de enfermedades infecciosas y aplicaciones de tratamiento tumoral.
El siguiente protocolo describe el entrenamiento completo para sintetizar polímeros poli(beta aminoésteres) modificados al final del oligopéptido – OM-pBAE que se utilizarán para la síntesis de nanopartículas. En el protocolo, también se incluye la formulación de nanopartículas. Además, también se proporcionan pasos críticos para el éxito del procedimiento y resultados representativos para garantizar que las formulaciones resultantes cumplan con las características de caracterización de control de calidad requeridas para definir un resultado positivo o negativo. Este protocolo se resume en la Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Después del brote de la pandemia de Covid-19 el año pasado, la importancia de las vacunas en términos de control de enfermedades infecciosas se ha manifestado como un componente crítico8. Los esfuerzos de científicos de todo el mundo han permitido el lanzamiento al mercado de muchas vacunas. Por primera vez en la historia, las vacunas de ARNm han demostrado su éxito previamente hipotético, gracias a su rápido diseño debido a su capacidad para adaptarse a cualquier antígeno nuevo en unos<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se agradece el apoyo financiero del MINECO/FEDER (subvenciones SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 y COV20/01100). CGF reconoció su beca de doctorado IQS.
Materials
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
Riferimenti
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