Här presenteras ett enkelt protokoll för att producera mRNA-nanopartiklar baserade på poly(beta aminoester) polymerer, lätta att skräddarsy genom att ändra det inkapslade mRNA. Arbetsflödet för att syntetisera polymererna, nanopartiklarna och deras in vitro-väsentliga karakterisering beskrivs också. Ett konceptbevis för immunisering läggs också till.
Vaccinering har varit en av de stora framgångarna i det moderna samhället och är oumbärlig för att kontrollera och förebygga sjukdomar. Traditionella vacciner bestod av hela eller delar av smittämnet. Det finns dock fortfarande utmaningar och ny vaccinteknik är obligatorisk. I detta sammanhang har användningen av mRNA för immuniseringsändamål visat en förbättrad prestanda, vilket framgår av det snabba godkännandet av två mRNA-vacciner som förhindrar SARS-CoV-2-infektion. Förutom framgång med att förebygga virusinfektioner kan mRNA-vacciner också användas för terapeutiska cancerapplikationer.
Ändå gör instabiliteten i mRNA och dess snabba clearance från kroppen på grund av närvaron av nukleaser dess nakna leverans inte möjlig. I detta sammanhang är nanomediciner, och särskilt polymera nanopartiklar, kritiska mRNA-leveranssystem. Syftet med denna artikel är således att beskriva protokollet för formulering och test av en mRNA-vaccinkandidat baserat på de proprietära polymera nanopartiklarna. Syntesen och den kemiska karakteriseringen av de poly(beta aminoesters) polymerer som används, deras hymering med mRNA för att bilda nanopartiklar och deras lyofiliseringsmetodik kommer att diskuteras här. Detta är ett avgörande steg för att minska lagrings- och distributionskostnaderna. Slutligen kommer de tester som krävs för att visa deras förmåga att in vitrotransfektera och mogna modell dendritiska celler att anges. Detta protokoll kommer att gynna det vetenskapliga samfundet som arbetar med vaccinering på grund av dess stora mångsidighet som gör det möjligt för dessa vacciner att förebygga eller bota en mängd olika sjukdomar.
Infektionssjukdomar har utgör ett allvarligt hot mot miljontals människor runt om i världen och är fortfarande en av de främsta dödsorsakerna i vissa utvecklingsländer. Profylaktisk vaccination har varit en av de mest effektiva interventionerna i det moderna samhället för att förebygga och kontrollera infektionssjukdomar1,2. Dessa kritiska milstolpar i vetenskapenunder 1900-talet har kommenterats av den senaste globala Covid-19-pandemin orsakad av SARS-CoV-2-viruset3. Med tanke på vikten av att ha effektiva vacciner för att begränsa spridningen av sjukdomen har samarbete från alla biomedicinska samhällen framgångsrikt resulterat i många profylaktiska vacciner på marknaden på mindre än ett år4.
Traditionellt bestod vacciner av dämpade (levande, minskad virulens) eller inaktiverade (dödspartiklar) virus. Men för vissa sjukdomar utan marginal för säkerhetsfel är viruspartiklar inte möjliga, och proteinunderenheter används istället. Subunits möjliggör dock vanligtvis inte kombinationen av mer än ett epitop/antigen, och adjuvanser krävs för att förbättra vaccinationspotensen 5,6. Därför står behovet av nya vaccintyper tydligt.
Som visats under den nuvarande pandemin kan nya vaccinkandidater baserade på nukleinsyror vara fördelaktiga när det gäller att undvika långa utvecklingsprocesser och ge hög mångsidighet samtidigt som de producerar en vital patientimmunisering. Detta är fallet med mRNA-vacciner, som ursprungligen utformades som experimentella cancervacciner. Tack vare deras naturliga förmåga att producera antigenspecifika T-cellssvar3,5,6,7. Att vara mRNA molekylen som kodar det antigena proteinet, bara ändra samma, vaccinet kan snabbt skräddarsys för att immunisera andra varianter av samma mikroorganism, olika stammar, andra infektiösa mikroorganismer, eller till och med bli en cancer immunoterapeutisk behandling. Dessutom är de fördelaktiga när det gäller storskaliga produktionskostnader. MRNA har dock ett betydande hinder som hindrar deras nakna administration: dess stabilitet och integritet äventyras i fysiologiska medier, fulla av nukleaser. Av denna anledning krävs användningen av en nanometrisk bärare som skyddar den och vektoriserar mRNA till de antigenpresenterande cellerna2,8.
I detta sammanhang är poly (beta aminoesters) (pBAE) en klass av biokompatibla och biologiskt nedbrytbara polymerer som visade en anmärkningsvärd förmåga att komplex mRNA i nanometriska partiklar, tack vare deras katjoniska laddningar9,10,11. Dessa polymerer består av esterbindningar, vilket gör nedbrytningen lätt av esteraser under fysiologiska förhållanden. Bland pBAE bibliotek kandidater, de functionaliserade med slutet katjoniska oligopeptides visade en högre kapacitet att bilda små nanopartiklar att effektivt penetrera celler genom endocytosis och transfect det inkapslade genmaterialet. Dessutom, tack vare deras buffringskapacitet, tillåter försurningen av endosomfacket endosomal flykt12,13. Nämligen en specifik typ av pBAE, inklusive hydrofoba moieties på ryggraden (den så kallade C6 pBAE) för att förbättra deras stabilitet och end-oligopeptide kombination (60% av polymer modifierad med en tri-lysin och 40% av polymeren med en tri-histidin) som selektivt transfekterar antigen-presenterande celler efter parenteral administrering och producerar mRNA-kodad antigenpresentation följt av möss immunisering har nyligen publicerats1 . Dessutom har det också visats att dessa formuleringar skulle kunna kringgå ett av de viktigaste flaskhalsstegen i nanomedicinska formuleringar: möjligheten att frysa dem utan att förlora sin funktionalitet, vilket möjliggör långsiktig stabilitet i mjuka torra miljöer15.
I detta sammanhang är syftet med det nuvarande protokollet att göra förfarandet för bildandet av mRNA-nanopartiklar tillgängliga för forskarsamhället genom att ge en beskrivning av de kritiska stegen i protokollet och möjliggöra produktion av effektiva vacciner för förebyggande av infektionssjukdomar och tumörbehandlingstillämpningar.
Följande protokoll beskriver den kompletta träningen för att syntetisera oligopeptid end-modified poly (beta aminoesters) – OM-pBAE polymerer som ytterligare kommer att användas för nanopartikelsyntes. I protokollet ingår också nanopartiklar formulering. Dessutom tillhandahålls kritiska steg för att förfarandet och representativa resultat också tillhandahålls för att säkerställa att de resulterande formuleringarna utför de nödvändiga kvalitetskontrollkarakteriseringsfunktionerna för att definiera ett positivt eller negativt resultat. Detta protokoll sammanfattas i figur 1.
Efter utbrottet av Covid-19-pandemin förra året har vikten av vacciner när det gäller infektionssjukdomskontroll manifesterats som en kritisk komponent8. Ansträngningar från forskare över hela världen har gjort det möjligt att släppa ut många vacciner på marknaden. För första gången i historien har mRNA-vacciner visat sin tidigare hypotetiska framgång, tack vare deras snabba design på grund av deras förmåga att anpassa sig till något nytt antigen inom några månader<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Ekonomiskt stöd från MINECO/FEDER (bidrag SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 och COV20/01100) bekräftas. CGF erkände sin IQS PhD Fellowship.
1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
Acetone | Panreac | 141007 | |
CD11b antibody | BD | 550993 | |
CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
Equipment | |||
Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
Software | |||
NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |