Kärnisolering från vuxen musnjure för RNA-sekvensering med en kärna

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera högkvalitativa kärnor från frysta musnjurar som förbättrar representationen av medullära njurcelltyper och undviker genuttrycksartefakter från enzymatisk vävnadsdissociation.

Abstract

Njurarna reglerar olika biologiska processer såsom vatten, elektrolyt och syra-bas homeostas. Fysiologiska funktioner i njurarna utförs av flera celltyper arrangerade i en komplex arkitektur över organets kortikomedullära axel. Nya framsteg inom encellstranskriptomik har påskyndat förståelsen av celltypspecifikt genuttryck inom njurfysiologi och njursjukdom. Enzymbaserade vävnadsdissociationsprotokoll, som ofta används för encells RNA-sekvensering (scRNA-seq), kräver emellertid mestadels färsk (icke-arkiverad) vävnad, introducerar transkriptionella stressresponser och gynnar valet av rikliga celltyper i njurbarken vilket resulterar i en underrepresentation av celler i medulla.

Här presenterar vi ett protokoll som undviker dessa problem. Protokollet är baserat på kärnisolering vid 4 °C från frusen njurvävnad. Kärnor isoleras från en central del av musnjuren som består av cortex, yttre medulla och inre medulla. Detta minskar överrepresentationen av kortikala celler som är typiska för helnjurprover till förmån för medullära celler så att data kommer att representera hela kortikomedulläraxeln vid tillräcklig överflöd. Protokollet är enkelt, snabbt och anpassningsbart och ger ett steg mot standardisering av transkriptomik med en kärna inom njurforskning.

Introduction

Njurar visar en mycket komplex vävnadsarkitektur. De består av funktionellt och anatomiskt åtskilda segment längs en kortikomedullära axel och förmedlar biologiska funktioner, som t ex reglering av extracellulär vätskevolym, elektrolytbalans eller syra-bashomeostas¹.

Framsteg inom encellstranskriptomik har möjliggjort en djupgående karakterisering av komplexa vävnader och påskyndat förståelsen av segment- och celltypspecifikt genuttryck inom njurfysiologi, utveckling och sjukdom ^2,3,4.

De enzymbaserade dissociationsprotokollen som ofta används för scRNA-seq uppvisar emellertid flera nackdelar och begränsningar. Beroende på protokollet genererar de transkriptionella stressreaktioner och vävnadsdissociationsbias mot lättare att dissociera kortikala celltyper ^5,6. Även om protokoll som använder kallaktiva proteaser för embryonala njurar kan mildra stressrelaterade transkriptionsförändringar, misslyckas de med att övervinna dissociationsbias mot kortikala celler och kanske inte lätt kan anpassas till olika typer av sjuka njurvävnader⁷. Dessutom är encellsmetoder inte lätt kompatibla med frysta vävnadsprover, vilket begränsar deras tillämpning mestadels till icke-arkiverad, färsk vävnad, vilket gör vävnadssamlingen till en begränsande faktor⁶.

RNA-sekvensering med en kärna (snRNA-seq) kan kringgå dessa begränsningar ^8,9. Här presenterar vi ett protokoll för kärnisolering från en central skiva av frusen vuxen njurvävnad från möss (Figur 1)¹⁰. Vårt protokoll är enkelt och ger ett standardiserat tillvägagångssätt för att erhålla RNA-sekvenseringsbibliotek med en balanserad representation av olika njurcelltyper för experimentella modeller som inte involverar starka regionala vävnadsförändringar. I det senare fallet kan vårt protokoll också utföras med hela njurar.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med djurskyddslagen (TierSchG) och djurskyddsförordningen (TierSchVersV) och godkändes av lokala myndigheter och djurskyddsansvariga vid vår institution (MDC). 1. Beredning av vävnad Förbered en 6-brunnsplatta innehållande 2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) per brunn för varje njure som kommer att erhållas. Bered en 6-brunnsplatta innehållande 2 ml RNA-stabiliseringslösning per brunn och njure. Förkyl båda plattorna på is. Avliva en 3 till 6 månader gammal manlig C57BL / 6-mus. Placera musen på en dissekeringsbricka, stift ner extremiteterna och sterilisera buken med 70% etanol. Öppna buken upp till bröstkorgen med pincett och sax. Lyft tarmarna och andra organ åt sidan och ta bort njurarna genom att försiktigt klippa urinledaren, njurartären och venen med en sax. Tvätta njuren i den tidigare beredda, iskalla 1x PBS och ta bort njurfascia och eventuellt kvarvarande fett från njuren tills all vit vävnad har avlägsnats (figur 2A). Placera njuren på en kall dissekeringsplatta och använd en skarp skalpell eller rakblad för att få en mittskiva på 1-2 mm. Se till att vävnadsdelen innehåller hela kortikomedulläraxeln (figur 2B). Använd mikrodissektion sax och pincett för att försiktigt trimma cortex från sidorna av mittstycket. Inom det dissekerade vävnadsstycket bör de tre segmenten cortex, yttre medulla och inre medulla vara tydligt synliga (figur 2C).OBS: Skivan bör inte överstiga en tjocklek av 2 mm eller en vikt av 20 mg för att säkerställa tillräckliga buffertmängder för effektiv vävnadslys och för att minimera omgivande bakgrunds-RNA i cDNA-biblioteken. Omgivande RNA slösar bort sekvenskapacitet, eftersom det inte är associerat med enstaka kärnor. Överför njurbiten till den tidigare beredda RNA-stabiliseringslösningen och inkubera i 24 timmar vid 4 °C för att undvika RNA-nedbrytning. Efter 24 timmar avlägsnas RNA-stabiliseringslösningen och vävnaden förvaras vid -80 °C tills den används ytterligare. Ta försiktigt bort överskottslösningen med silkespapper. 2. Isolering av kärnor Rengörings- och förberedelsesteg Rengör bänkskivor och pipetter med 70% etanol och RNas-dekontamineringslösning. Rengör ett rundbottnat 2 ml vävnadskvarnrör och matchande stöt A och B med RNase-dekontamineringslösning, följt av 70% etanol och RNasfritt vatten (1 kvarnrör och mortelstöt per prov). Låt det torka helt. Förkyl centrifugen till 4 °C. Märk och förkyl tre 15 ml uppsamlingsrör, ett 1,5 ml uppsamlingsrör, ett 5 ml uppsamlingsrör för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och ett torrkvarnrör för varje prov på is. Förberedelse av buffert Värm upp stamlösningen ribonukleosid-vanadin till 65 °C tills den beretts till en grönsvart klar lösning enligt tillverkarens anvisningar. 11 Bered 1x PBS innehållande 4 % bovint serumalbumin (BSA) enligt beskrivningen i tabell 1A. Förbered dessutom 1x PBS med 0,04% BSA (tabell 1B). Filtrera båda lösningarna med ett 0,2 μm ytaktivt cellulosaacetat (SFCA) membransprutfilter och håll isen tills vidare användning. Förbered kärnlysbuffert 1 (NLB1, tabell 1C). Tillsätt 4 ml EZ-lysbuffert för Nuclei Lysis Buffer 2 (NLB2, tabell 1D) och 2 ml 0,04 % BSA / PBS för Nuclei Suspension Buffer (NSB, tabell 1E) till 15 ml rör. Tillsätt RNase-hämmarelösningen till NLB2 och NSB direkt före användning enligt vad som anges nedan i protokollet. Håll på is tills vidare användning. Förbered EZ-lysbuffert med 10% sackaros (sackarosgradientbuffert, tabell 1F). Blanda väl och filtrera bufferten till ett nytt 15 ml rör med ett 0,2 μm SFCA-membransprutfilter. Håll på is tills vidare användning. Vävnadshomogenisering och celllysOBS: För att minimera RNA-nedbrytning utförs alla steg på is. Kvarnröret, petriskålen och alla buffertar måste förkylas. Alla resuspensionssteg görs genom att försiktigt pipettera kärnsuspensionen. Virvla inte provet för att undvika skjuvkrafter och skador på kärnor.Ta den frysta njurbiten och överför den till en 60 mm polystyren petriskål på is innehållande 1 ml NLB1. Finhacka vävnaden noggrant med ett rakblad eller skalpell (figur 3A). Skär av spetsen på en 1 ml pipettspets och överför malet vävnad och buffert till kvarnröret. Se till att överföra alla vävnadsbitar. Tvätta petriskålen 5-10 gånger med bufferten, om det behövs. Homogenisera suspensionen på is genom att långsamt flytta stöt A, 25x upp och ner i kvarnröret. Undvik luftbubblor orsakade av snabba rörelser (figur 3B). För homogenatet genom en sil på 100 μm i ett förkylt 15 ml uppsamlingsrör och tvätta filtret med ytterligare 1 ml NLB1. Tvätta kvarnröret med kall EZ-nukleilysbuffert och kassera bufferten. Överför homogenatet tillbaka till kvarnröret och homogenisera suspensionen på is genom att långsamt flytta stöt B, 15x upp och ner i kvarnröret. Undvik luftbubblor orsakade av snabba rörelser (figur 3C). Överför homogenatet till ett förkylt 15 ml uppsamlingsrör. Tvätta kvarnröret med ytterligare 2 ml NLB1 och se till att överföra alla vävnadsfragment till uppsamlingsröret. Inkubera homogenatet (total volym 4 ml) i 5 minuter på is för att lysera cellerna. Rening av kärnor För homogenatet genom en sil på 40 μm till ett förkylt 15 ml uppsamlingsrör. Snurra uppsamlingsröret i 5 minuter vid 500 x g vid 4 °C i en centrifug med en svängskoprotor. Under tiden tillsätts RNase-hämmare till NLB2 (tabell 1D). Ta bort supernatanten utan att störa pelleten. Resuspendera försiktigt pelleten i 4 ml NLB2. Täck försiktigt fjädringen med en 1 ml kudde av sackaros gradientbuffert. Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C i en centrifug med en svängskoprotor. Under tiden tillsätts RNase-hämmare till NSB (tabell 1E). Efter centrifugering avlägsnas uppsamlingsröret försiktigt från centrifugen och var försiktig så att de två skikten inte störs vid hantering av uppsamlingsröret. Cellskräp är synligt mellan de två skikten. Ta bort supernatanten försiktigt och börja med skräpet. Ta bort den återstående supernatanten utan att störa kärnpelleten och suspendera försiktigt pelleten igen i 1 ml NSB.OBS: Resuspensionsvolymen beror på mängden vävnad som används för isoleringen och pelletsstorleken som erhållits efter det sista centrifugeringssteget. Volymen kan behöva anpassas till det förväntade antalet kärnor. För homogenatet genom en 20 μm sil in i det förkylda 5 ml FACS-uppsamlingsröret. 3. Sortering av kärnor Tillsätt 20 μl 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) per ml NSB till en slutlig koncentration på 2 μM till homogenatet i FACS-uppsamlingsröret och blanda försiktigt. Inkubera i 5 min på is. Bered det förkylda 1,5 ml uppsamlingsröret med 20 μl 4 % BSA/1x PBS och tillsätt 0,5 μL RNas-hämmande lösning till en slutlig koncentration på 1 E/μl. Fortsätt omedelbart till sorteringen. Sortera kärnorna med hjälp av en cellsorterare.Blanda kärnsuspensionen en kort stund innan du sätter in FACS-uppsamlingsröret i sorteraren. Ställ in en första grind P1 baserad på framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) för att utesluta skräp och aggregat (figur 4A). För att utesluta tomma eller skadade kärnor och multipler, ställ in en efterföljande grind baserat på DAPI-området kontra DAPI-höjden (DAPI-A vs DAPI-H) (figur 4B). Sortera enstaka kärnor i 1,5 ml uppsamlingsröret innehållande 4% BSA / 1x PBS med 1 U / μL RNas-hämmarelösning beredd i 3.2. 4. Kvalitetskontroll Mät den slutliga kärnkoncentrationen i ett fluorescensmikroskop eller i en automatisk räknekammare i minst två oberoende räkningar och bedöm suspensionskvaliteten (figur 5).OBS: Optimala koncentrationer är mellan 700 – 1 200 kärnor / μL. Lägre cellkoncentrationer såsom 700 kärnor / μL kan vara att föredra eftersom resulterande cDNA-bibliotek innehöll mindre omgivande bakgrunds-RNA (transkript som inte är associerade med enskilda kärnor). Beräkna den erforderliga volymen kärnsuspension för önskad återvinning av sekvenserade enskilda kärnor. För att undvika nukleiaggregering och RNA-nedbrytning, fortsätt omedelbart till biblioteksberedning.

Representative Results

För att bestämma prestandan för vårt protokoll använde vi 10x Genomics Chromium Single Cell 3 ‘Gene Expression Kit v3.1 för biblioteksberedning och analyserade snRNA-seq-data med Seurat -paketet12,13. Figur 6 visar resultat från ett representativt snRNA-seq-bibliotek. För att bedöma kvaliteten på våra kärnor plottade vi antalet gener mot antalet transkript (definierade av unika molekylära identifierare (UMI)) färgade av fraktionen av mitokondriella läsningar (figur 6A). Kärnor av god kvalitet visar i allmänhet högre antal läsningar, korrelerar UMI- och gennummer och låga mitokondriella läsfraktioner. För den efterföljande analysen uteslöts kärnor med mindre än 500 eller mer än 4000 räknade gener, eller mer än 5% av mitokondriellt RNA (n = 828). Endast gener uttryckta i minst tre kärnor inkluderades. Vi upptäckte cirka 20 000 gener totalt i de återstående 6 000 kärnorna med 1 600 mediangener och 2 800 median UMI per kärna (figur 6B). Klustring baserades på mycket varierande gener. Vi identifierade totalt 18 kluster. Cellidentiteter annoterades baserat på kända markörgener (visas inte). Underkluster av en celltyp sammanfattades till ett kluster vilket resulterade i totalt 11 distinkta celltyper: podocyter, proximal tubuli (PT), tunn lem (tL), tjock stigande extremitet (TAL), distal krökt tubuli (DCT), anslutande tubuli (CNT), uppsamling av kanalhuvudceller och interkalerade celler (CD-PC, A-IC, B-IC), djupt medullärt epitel i bäckenet (DMEP) och endotel. Genuttrycksmönster för klusterberikade markörer visualiserades i ett punktdiagram (figur 6C) och celltypkluster i ett t-distribuerat stokastiskt granninbäddningsdiagram (t-SNE) (figur 6D). För att bedöma celltypfördelningar i vårt prov beräknades procentandelen av varje celltyp (figur 6E) och användes för att bestämma förhållandet mellan PT och TAL. PT finns huvudsakligen i njurbarken och är ofta överrepresenterad i njurens encellsdataset eftersom celler i PT är lätta att dissociera och mycket rikliga i hela njurprover. TAL å andra sidan sträcker sig över hela den yttre medulla14. Således representerar förhållandet mellan PT- och TAL-fraktioner ett bra mått för anrikning av medullära celltyper i en njure-encellsdataset. I allmänhet varierade PT/TAL-förhållandet i encellsdataset för hela njurar från 8 (opublicerade data från kallproteasbehandlad hel njurvävnad) till 45 för enzymatiskt dissocierad vävnad10,14,15. I snRNA-seq-datasetet som presenteras här kunde vi nå ett PT/TAL-förhållande på 2. Detta resultat illustrerar att avlägsnande av överskott av cortex under vävnadsdissektion i kombination med snRNA-seq resulterar i en påfallande förbättrad njurcellstyprepresentation. Figur 1: Schematisk översikt över arbetsflödet. Protokollet består av fyra huvudsteg som inkluderar vävnadsdissektion följt av kärnisolering, kärnsortering och en slutlig renhets- och koncentrationsbedömning. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Njurdissektion och vävnadsberedning . (A) Representativ bild av dissekerad hel njure. De streckade linjerna anger de snitt som krävs för att erhålla en mittskiva på 1-2 mm med en representation av alla njurcelltyper. (B) Representativ bild av erhållen mittskiva. De prickade linjerna indikerar skärningarna för cortex trimning från sidan. (C) Representativ bild av central njurbit med trimmad cortex. Cortex (C), yttre medulla (OM) och inre medulla (IM) är tydligt synliga. Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Vävnadshomogenisering och kärnrening . (A) Representativ bild som visar tillräckligt malet njurvävnad. Skalstång = 500 μm. (B) Homogenat efter första homogeniseringssteget (25 slag med stöt A, 2 ml kvarnrör). (C) Homogenera efter det andra homogeniseringssteget (15 slag med stöt B, 2 ml kvarnrör). Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 4: Gating strategi för kärnsortering. (A ) En första grind P1 sattes baserat på framåtspridning (FSC) vs sidospridning (SSC) för att utesluta skräp och aggregat. (B ) En efterföljande grind baserad på DAPI-område (DAPI-A) vs DAPI-höjd (DAPI-H) utesluter tomma eller skadade kärnor och multiplar. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 5: Kärnsuspension före och efter kärnsortering. (A, C) DAPI-färgade kärnor (blå). (B, D) Överlagring av DAPI- och brightfield-kanal (BF). Före sortering (övre panel) innehåller kärnsuspensionen cellskräp och aggregat (märkta med vita pilspetsar). Efter sortering (nedre panelen) verkar kärnsuspensionen mycket renare. Exempel på DAPI-färgade kärnor är märkta med svarta pilspetsar. Kärnor av god kvalitet verkar runda och släta med ett intakt membran och är väl separerade, medan kärnor av dålig kvalitet verkar skrynkliga och visar förlust av kärnmembranet. Skalstapel = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 6: Kvalitetskontroll och analys av ett representativt snRNA-seq-dataset. (A) Antal gener (nGene) plottade mot antalet unika molekylära identifierare (nUMI) färgade av andelen mitokondriella läsningar (percent.mt). Kärnor av låg kvalitet motsvarar diagrammets nedre vänstra kvadrant (n = 828) och uteslöts från efterföljande analys. (B) Distribution och median av nGene och nUMI detekterad per kärna i snRNA-seq-datasetet, vilket representerar 6 177 kärnor (> 500 gener). Bibliotek sekvenserades till ett mediandjup på ~ 8 200 mappade läsningar per kärna. (C) Punktdiagram som visar genuttrycksmönster för klusterberikade markörer (x-axeln) för enskilda celltyper (y-axeln). Storleken på punkten motsvarar andelen celler som uttrycker den angivna genen. Färgen motsvarar det genomsnittliga uttrycket. (D) T-distribuerad stokastisk granninbäddning (t-SNE) diagram över identifierade celltyper. (E) Celltypfördelning i snRNA-seq-dataset. PT, proximal tubuli; tL, tunn lem; TAL, tjock stigande lem, DCT, distal krökt tubuli; CNT, anslutande tubuli; CD-PC, uppsamling av huvudceller; A-IC, typ A interkalerade celler; B-IC, typ B interkalerade celler; DMEP, djupt medullärt epitel i bäckenet. Klicka här för att se en större version av denna figur. Reagens Slutlig koncentration Volym (ml) A) 4 % BSA/PBS Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 10% bovint albumin 4% 2 PBS (fosfatbuffrad saltlösning) 1X utan kalcium eller magnesium – 3 (B) 0,04 % BSA / PBS 4 % BSA / PBS 0.04 % 0.5 PBS (fosfatbuffrad saltlösning) 1X utan kalcium eller magnesium – 49.5 c) Kärnlysbuffert 1 (NLB1) Nukleär EZ-lysbuffert – 4 RiboLock RNas-hämmare (40 E/μl) 1 E/μL 0.1 Ribonukleosid-vanadylkomplex (200 mM) 10 mM 0.2 d) Kärnlysbuffert 2 (NLB2) Nukleär EZ-lysbuffert – 4 RiboLock RNas-hämmare (40 E/μl) 1 E/μL 0.1 e) Suspensionsbuffert för kärnkärnor (NSB) 0,04 % BSA / PBS – 2 RiboLock RNas-hämmare (40 E/μl) 1 E/μL 0.05 f) Sackarosgradientbuffert (10 % sackaros) Vikt 1 g sackaros Lös i 6 ml nukleär EZ-lyseringsbuffert Fyll upp till 10 ml med Nuclear EZ Lysis Buffer Filtrera genom ett 0,2 μm sprutfilter i en ny slang Tabell 1: Lösningsrecept: (A) Beredning av 4% BSA/1x PBS. Filtrera med ett 0,2 μm SFCA-membransprutfilter och håll isen tills användning. (B) Beredning av 0,04% BSA/1 x PBS. Filtrera med ett 0,2 μm SFCA-membransprutfilter och håll isen tills användning. c) Beredning av nukleilysbuffert 1 (NLB1). Angivna volymer anges per prov. Håll på is tills användning. d) Beredning av nukleilysbuffert 2 (NLB2). Angivna volymer anges per prov. Lägg till RiboLock RNase-hämmare till NLB2 direkt före användning enligt protokollet. Håll på is tills användning. e) Beredning av kärnsuspensionsbuffert (NSB). Angivna volymer anges per prov. Lägg till RiboLock RNase-hämmare till NSB direkt före användning enligt protokollet. Håll på is tills användning. f) Beredning av sackarosgradientbuffert. Filtrera med ett 0,2 μm SFCA-membransprutfilter och håll isen tills användning.

Discussion

Encellstranskriptomik främjar förståelsen av celltypspecifikt genuttryck inom njurfysiologi och njursjukdom. Här tillhandahöll vi en enkel och reproducerbar metod för att isolera högkvalitativa enskilda kärnor från frusen musnjurvävnad för snRNA-seq på ett standardiserat sätt.

För snRNA-seq är det viktigt att använda högkvalitativa kärnor som indata för biblioteksgenerering och för att undvika RNA-nedbrytning under vävnadsbearbetning. Därför är inkubation av vävnadsbitar i RNA-stabiliseringslösning omedelbart efter dissektion avgörande för att skydda och stabilisera cellulärt RNA och gör det möjligt att lagra prover vid – 80 ° C på obestämd tid. Vid tillämpning av detta protokoll på fryst vävnad utan RNA-stabiliseringslösningsbehandling, såsom arkivmaterial, krävs en provkörning och RNA-kvaliteten måste bedömas eftersom vi observerade en signifikant förlust av RNA-integritet i snapfryst vävnad utan föregående inkubation i RNA-stabiliseringslösning.

I allmänhet är lämplig provhantering avgörande för att maximera återvinningen av intakta, enskilda kärnor. Alla resuspensionssteg ska utföras genom pipettering försiktigt för att undvika skjuvspänning och fysisk skada. Buffertar för den slutliga kärnresuspensionen och kärnsorteringen bör innehålla BSA för att undvika kärnförlust och aggregering.

Buffertvolymerna i detta protokoll är optimerade för mycket små vävnadsprover (~15 mg). Det är viktigt att säkerställa fullständig celllys och tillräcklig tvättning för att generera högkvalitativa suspensioner. Större vävnadsblock eller hela njurprover kommer att resultera i alltför höga kärnkoncentrationer som leder till klumpning och aggregering, hög överflöd av omgivande RNA och övergripande dålig suspensionskvalitet. Om större prover eller andra vävnader bearbetas rekommenderas det starkt att utföra provkörningar för att bestämma optimala buffertvolymer för minimala omgivande RNA-nivåer. Kärnor och RNA-kvalitet och koncentrationer måste undersökas noggrant eftersom överbelastning resulterar i övergripande dålig prestanda.

Dessutom påverkar stora mängder cellskräp, som orsakar höga nivåer av omgivande RNA som inte är associerade med enskilda kärnor, sekvenseringsresultaten negativt. Förtydligande av kärnsuspensionen genom centrifugering genom en sackaroskudde mildrar detta problem till viss del, men det kan också leda till bias i celltypsrepresentation genom motselektion mot täta, små kärnor som till exempel finns i immunceller¹⁶. Om detta är oroande bör sackarosgradienten utelämnas. Däremot fann vi att flödescytometri baserad på DAPI-färgning var avgörande för att minska mängden cellskräp för att producera en högkvalitativ enkärnig suspension.

Isoleringen av enstaka kärnor har betydande fördelar jämfört med encellsmetoder⁸. Den är kompatibel med korrekt frusen vävnad, vilket gör vävnadssamlingen mer flexibel och kringgår behovet av enzymbaserad vävnadsdissociation, vilket kan införa transkriptionella stressreaktioner ^6,17. Dessutom övervinner den dissociationsförspänningen som gynnar valet av lätt dissocierbara celltyper i njurbarken, vilket kan leda till en underrepresentation av medullära celltyper i vissa enzymbaserade tillvägagångssätt ^5,6,10.

Att använda en central njurbit istället för hel njurvävnad sparar ytterligare resurser och korrigerar för överrepresentation av rikliga celltyper som beskrivits tidigare¹⁰. Beroende på vilken musmodell eller fenotyp som undersöks kan det dock vara fördelaktigt att använda hela njurprover istället för en enda mittskiva. Hela njurprover kan vara mer representativa för sanna cellproportioner eller förändringar som förekommer i hela njuren, medan en trimmad mittskiva visade sig vara fördelaktig för medullära fenotyper eller när provmaterialet var begränsat. Detta beslut är därför mycket användarspecifikt och bör övervägas noggrant.

Materials

Cell sorter	–	–	For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000015
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000	Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope.
4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI)	Biotrend	40043/b	Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM.
D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free	VWR	0335-500G
DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	22431021
Ethanol, 70 %	–	–
FACS tubes	pluriSelect	43-10100-46
KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma-Aldrich	D8938-1SET
Minisart Syringe Filters 0.2 µm	Sartorius	16534-GUK
Nuclease-free Water	Invitrogen	AM9937
Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit	Sigma-Aldrich	NUC-101	Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation.
PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium	Corning	21-040-CV
Petri dishes, polystyrene 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	SRE0036
pluriStrainer Mini 100 µm	pluriSelect	43-10100-46
pluriStrainer Mini 20 µm	pluriSelect	43-10020-40
pluriStrainer Mini 40 µm	pluriSelect	43-10040-40
Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL)	Falcon	352099
Razor blades	–	–
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	EO0384
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S	Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C.
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020
RNase AWAY	Fisher Scientific	11952385